基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法与流程

本发明属于水产良种繁育领域，具体地涉及一种基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法。

背景技术：

1、生殖干细胞移植技术是制备优异水产新种质的前沿育种技术。该技术是将供体生殖干细胞移植到受体中，待受体成熟后产生供体的配子，再经人工授精获得供体后代。该技术可以显著缩短育种周期，并由于生殖干细胞具有双向分化潜能，因而在性别控制育种中具有良好的应用前景。

2、不育受体制备是生殖干细胞移植技术的关键环节之一。目前不育受体的主要制备方法包括：生殖关键基因的敲降或敲除、三倍体诱导和高温-化学药物联合处理等。前两种方式主要在受精卵或早期胚胎时期开始处理，并可取得较好的效果，但对于多数海水养殖鱼类，因性成熟时期长、培养过程中易面临逆境、疫病等胁迫因素，成活率受到影响。

3、红鳍东方鲀(takifugu rubripes)肉质鲜嫩、营养丰富，素有“鱼中之王”的美称，是我国北方出口创汇重要的名优养殖对象，利用生殖干细胞移植技术开展红鳍东方鲀优异种质创制是产业发展的迫切需要。红鳍东方鲀受精卵为沉性卵，具有粘性，卵膜厚且不透明，雄鱼和雌鱼分别需要2和3年才可达到性成熟，限制了生殖关键基因敲降或敲除、三倍体诱导等技术在不育受体制备中的应用。传统的白消安处理可以引起红鳍东方鲀精巢的明显退化，但部分精小囊中仍残留各种分化时期的生殖细胞，因此将影响生殖干细胞移植的效率。

技术实现思路

1、本发明提供了基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，该方法获得的不育受体内源生殖干细胞几乎完全枯竭，并在进行生殖干细胞移植后，可以观察到外源供体的成功定植，将具有抗病、抗逆、速生等优异性状的红鳍东方鲀精原干细胞移植到成鱼不育受体体内，能够快速产生优异性状亲代的成熟精子，从而缩短了育种时间。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，所述方法包括不育受体的制备、精原干细胞的制备和移植；

4、所述不育受体的制备，在产卵季节过后对红鳍东方鲀雄鱼进行高温培养，在高温培养阶段向红鳍东方鲀雄鱼性腺部位多次注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，进而获得红鳍东方鲀不育受体，红鳍东方鲀雄鱼为性腺发育完全且产精后的雄性红鳍东方鲀；

5、进一步的说，所述的高温培养为对性腺发育完全且产精后的雄性红鳍东方鲀成鱼每天升高1℃至32℃进行高温养殖，适应1周后注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，注射间隔为14天，共注射3次，进而获得红鳍东方鲀不育受体。

6、进一步，所述终浓度为30mg/kg的白消安溶液制备方法，将白消安药物粉末溶解至细胞培养级dmso中，配制为4mg/ml的母液。

7、进一步，所述注射方式为通过生殖孔向红鳍东方鲀鱼体性腺注射。

8、具体的，对雄性红鳍东方鲀成鱼进行第一次白消安注射，通过生殖孔向鱼体注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，随后继续高温培养14天；之后对雄性红鳍东方鲀成鱼进行第二次白消安注射，通过生殖孔向鱼体注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，随后继续高温培养14天；之后，对雄性红鳍东方鲀成鱼进行第三次白消安注射，通过生殖孔向鱼体注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，随后继续高温培养14天；之后，按照每天降1℃的方式降低到红鳍东方鲀正常养殖温度。

9、所述的精原干细胞的制备，从雄性性腺未发育成熟的红鳍东方鲀的精巢组织中分离精原干细胞；

10、所述的移植，将精原干细胞通过生殖孔移植进入不育受体的性腺中，移植一个月后，检测定植效率，将定植成功的红鳍东方鲀养殖到性腺发育成熟即可产生携带有优良品种基因的精子用于苗种繁育。

11、本发明与现有技术相比的有益效果为：

12、本发明为快速高效制备红鳍东方鲀不育受体的方法，该方法可用于快速、高效地枯竭繁殖期成年雄性红鳍东方鲀性腺生殖细胞数量，并对不育受体进行生殖干细胞移植；其为海水鱼类成年不育受体制备、同种移植以及缩短种质创制周期提供了新方法；具体为：

13、本发明方法通过生殖孔注射，直接将白消安溶液注入红鳍东方鲀性腺部位，可降低使用白消安试剂的用量，减小对成年红鳍东方鲀的毒害，并同时可保证良好的内源生殖细胞枯竭效果，统计处理前后红鳍东方鲀生长指标、成活率；

14、本发明方法使用性腺发育成熟的成年雄性红鳍东方鲀作为实验对象，经处理后当代即可用于生殖干细胞移植，比使用胚胎或仔稚鱼制备不育受体的方法节省了养殖至性成熟的时间；

15、本发明方法中利用高温-白消安处理后的所有红鳍东方鲀性腺均发生显著退化，处理效率高；

16、本发明方法经h&e染色，鉴定出红鳍东方鲀性腺中精母细胞和精子发生了枯竭，不影响精原干细胞的正常生存与增殖，性腺状态适宜接受外源精原干细胞定植；

17、本发明使用percoll纯化并荧光染色的红鳍东方鲀生殖干细胞为供体进行移植，移植一个月后，供体生殖干细胞在成年雄性红鳍东方鲀不育受体性腺中的定植效率为75％，表明红鳍东方鲀生殖干细胞移植不育受体效果理想。

技术特征：

1.一种基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，其特征在于，所述方法包括不育受体的制备、精原干细胞的制备和移植；

2.根据权利要求1所述的一种基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，其特征在于，所述的高温培养为对性腺发育完全且产精后的雄性红鳍东方鲀成鱼每天升高1℃至32℃进行高温养殖，适应1周后注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，注射间隔为14天，共注射3次，进而获得红鳍东方鲀不育受体。

3.根据权利要求1所述的一种基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，其特征在于，终浓度为30mg/kg的白消安溶液制备方法，将白消安药物粉末溶解至细胞培养级dmso中，配制为4mg/ml的母液。

4.根据权利要求1所述的一种基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，其特征在于，所述注射方式为通过生殖孔向红鳍东方鲀鱼体性腺注射。

5.根据权利要求4所述的一种基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，其特征在于，对雄性红鳍东方鲀成鱼进行第一次白消安注射，通过生殖孔向鱼体注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，随后继续高温培养14天；之后对雄性红鳍东方鲀成鱼进行第二次白消安注射，通过生殖孔向鱼体注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，随后继续高温培养14天；之后，对雄性红鳍东方鲀成鱼进行第三次白消安注射，通过生殖孔向鱼体注射终浓度为30mg/kg的白消安溶液，随后继续高温培养14天；之后，按照每天降1℃的方式降低到红鳍东方鲀正常养殖温度。

技术总结本发明涉及基于红鳍东方鲀生殖干细胞移植到成体不育受体进行制种的方法，属于水产良种繁育领域，所述方法在产卵季节过后对红鳍东方鲀雄鱼进行高温培养，在高温培养阶段向其雄鱼性腺部位多次注射白消安溶液，获得红鳍东方鲀不育受体；将红鳍东方鲀精原干细胞移植进入不育受体的性腺中，将定植成功的红鳍东方鲀养殖到性腺发育成熟即可产生携带有优良品种基因的精子用于苗种繁育。本发明方法可用于快速、高效地枯竭繁殖期成年雄性红鳍东方鲀性腺生殖细胞数量，并对不育受体进行生殖干细胞移植；其为海水鱼类成年不育受体制备、同种移植以及缩短种质创制周期提供了新方法。技术研发人员：王倩,邵长伟,刘凯强,刘宇岩,王洪岩,曹绪文,和杨斌,孟博受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所技术研发日：技术公布日：2024/11/14