一种普拉梭菌微生物抗炎分子及其筛选方法和应用

本技术涉及生物，尤其是涉及一种普拉梭菌微生物抗炎分子及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)是消化道的顽疾之一，主要包括克罗恩病(crohn's disease，cd)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)。与其他消化道疾病相比，ibd具有治疗费用昂贵、治愈困难且复发率高等特征，严重影响患者的生活质量。

2、在免疫反应中，nf-κb作为炎症应答中最关键的转录因子，参与固有免疫和适应性免疫反应。在ibd患者或其他急慢性肠炎患者肠道组织中，nf-κb信号通路被激活，诱导产生大量的促炎细胞因子而诱导炎症的发生。这些细胞因子分两类，一类是促进先天免疫免疫的细胞因子，如ⅰ型干扰素(ifnβ)，il-12和巨噬细胞趋化因子等；另一类是促进获得性免疫的细胞因子，如il-1，il-2，il-6，il-8，il-12，il-18和ⅱ型干扰素(ifnγ)。肿瘤坏死因子tnfα是最主要的促炎因子之一，在肠上皮细胞，内皮细胞和固有层免疫细胞中均可表达。tnfα是ibd的发病机制中重要的调节因子。首先，tnfα可诱导上皮细胞紧密连接破坏，改变肠上皮屏障功能，影响肠通透性；其次，tnfα可以促进ceacam6的表达，介导免疫组织损伤，增加肠道细菌的入侵和感染。

3、目前，临床常用的治疗ibd的药物包括氨基水杨酸类、糖皮质激素、抗菌素、免疫抑制剂均可通过抑制nf-κb信号通路和炎症反应发挥作用，英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木(adalimuma)、聚乙二醇化西他丽珠(certolizumab)也是以tnfα为靶点的治疗药物。然而，这些药物均存在明显的副作用，疗效不持久且容易复发，对不同患者的治疗效果差异很大。因此，急需寻找更安全有效的抑制nf-κb信号通路和tnfα的物质。

4、研究表明，肠道微生物组对维持肠道稳态和人体健康至关重要，肠道微生物组的变化与肠内慢性炎症相关疾病的密切相关。粪菌治疗，也称粪菌移植(fecal microbiotatransplanation,fmt)或肠菌移植，是将健康人粪便中的功能菌群通过一定方式移植到患者肠道内，恢复健康的肠道菌群的多样性，实现肠道及肠道外疾病的治疗。目前，粪菌移植已被视为一种特殊的器官移植，用于炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征、神经发育不良与神经退行性疾病、自身免疫性肠病等。然而，粪菌移植受限于其健康供体的筛选、粪菌的制备、患者的接受程度、治疗效果等。粪菌移植健康供体的筛选极其严格，健康供体的饮食、睡眠质量、药物使用等均会影响其菌群的组成和丰度，最终影响治疗效果。因此，筛选有效的菌株及其组分进行消化系统炎症反应的治疗及其重要。

5、普拉梭菌(faecalibacterium prausnitzii,f.prausnitzii)是一种主要存在于回肠末端及回盲部的厌氧菌，约占健康成人粪便总菌群的5-15％，是健康成年人肠道菌群中最丰富的的共生菌之一。在前期研究中发现，肠道菌群，尤其是f.prausnitzii在uc的发生、发展及预后中起着十分重要的作用。f.prausnitzii的减少程度与ibd病情严重程度及预后密切相关。此外，在nafld患者的粪便中，f.prausnitzii的丰度也显著减少，补充f.prausnitzii可以改善nafld小鼠的脂质沉积。近年来，科学家在f.prausnitzii培养上清液中发现了一个15kda的蛋白，该蛋白不仅能够抑制肠上皮细胞nf-κb信号通路，还能显著降低dnbs或dss诱导的小鼠肠道炎症，被称为微生物抗炎分子(microbial anti-inflammatory molecule，mam)。根据根据文献报道和菌株分类数据库lpsn显示，faecalibacterium prausnitzii菌属被分成了7个种。探索每个菌株的抗炎作用对于筛选益生菌株及其重要。而mam作为f.prausnitzii最重要的抗炎蛋白，可以通过筛选mam的抗炎效果来判定该菌株的作用。

6、目前，炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征和自身免疫性肠病均缺乏有效的治疗措施，粪菌移植作为一种治疗手段，受限于健康供体的筛选、粪菌的制备、组分的多样性和不确定性，其治疗效果存在很大差异。普拉梭菌作为健康成年人肠道菌群中最丰富的的共生菌之一，已有研究报道可以改善炎症性肠病和非酒精性脂肪性肝病的进展，然而，不同普拉梭菌菌株的作用效果并不一致。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种普拉梭菌微生物抗炎分子及其筛选方法和应用。本技术筛选出来的普拉梭菌微生物抗炎分子的抗炎作用可达到90％以上。具有使用剂量小，抗炎作用强的优势。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种普拉梭菌微生物抗炎分子，所述普拉梭菌微生物抗炎分子的氨基酸序列如(a)或(b)所示；

4、(a)氨基酸序列如seq id no.1所示；

5、(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗炎活性的由(a)衍生的蛋白质。

6、作为本技术所述普拉梭菌微生物抗炎分子的优选实施方式，所述普拉梭菌微生物抗炎分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。

7、本技术筛选得到的普拉梭菌微生物抗炎分子可以在低剂量的使用前提下，具有较强的抗炎作用。相比于faecalibacterium菌属的代表菌株a2-165的微生物抗炎分子蛋白对nf-κb信号通路和炎症因子tnfα的抑制作用分别为50％和56％，而本技术筛选得到的普拉梭菌微生物抗炎分子的抗炎作用(抑制nf-κb信号通路)可以达到90％以上。

8、优选地，所述普拉梭菌微生物抗炎分子来源于cncm i 4644菌株(核苷酸序列可以从ncbi数据库中获得)。

9、第二方面，本技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述普拉梭菌微生物抗炎分子。

10、第三方面，本技术提供了一种表达载体，所述表达载体携带上述核酸分子。

11、作为本技术所述表达载体的优选实施方式，所述表达载体包括真核表达载体pcdna3.1。

12、第四方面，本技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述普拉梭菌微生物抗炎分子或核酸分子或表达载体。

13、作为本技术所述宿主细胞的优选实施方式，将nf-κb荧光素酶报告基因载体或炎症细胞因子tnfα启动子的荧光素酶报告基因载体转入至宿主细胞内。

14、第五方面，本技术提供了一种上述普拉梭菌微生物抗炎分子的筛选方法，包括以下步骤：

15、s1、从ncbi数据库中获得faecalibacterium不同菌株的基因组序列；

16、s2、将faecalibacterium不同菌株的微生物抗炎分子克隆至真核表达载体上，与nf-κb荧光素酶报告基因载体或炎症细胞因子tnfα启动子的荧光素酶报告基因载体共转入宿主细胞中，筛选对nf-κb和tnfα的表达有抑制作用的普拉梭菌微生物抗炎分子。

17、本技术针对临床肠道炎症治疗的常用靶点，即nf-kb信号通路和促炎因子tnfα的表达进行设计，引入荧光素酶报告基因载体这一灵敏性好、可精确定量的方法，在肠上皮细胞系上对faecalibacterium菌属的微生物抗炎分子进行筛选。

18、优选地，所述普拉梭菌微生物抗炎分子的筛选方法，具体包括以下步骤：

19、1、ncbi数据库中下载71种faecalibacterium菌属的菌株基因组序列，通过序列比对找出编码微生物抗炎分子的基因序列并翻译成氨基酸序列，通过mega-x软件对以上微生物抗炎分子的氨基酸序列进行进化分析，发现其至少可分为7个谱系。

20、2、从faecalibacterium菌属的7个谱系中选择代表菌株，将其微生物抗炎分子序列克隆到真核表达载体上，与nf-κb荧光素酶报告基因载体或炎症细胞因子tnfα启动子的荧光素酶报告基因载体共转入肠上皮细胞系hct116中，筛选对nf-κb和tnfα的表达有抑制作用的mam蛋白，发现a谱系的菌株对nf-κb和tnfα的抑制作用更强。

21、3、进一步筛选5株a谱系的菌株，将其微生物抗炎分子序列分别克隆到真核表达载体上，与nf-κb荧光素酶报告基因载体或炎症细胞因子tnfα启动子的荧光素酶报告基因载体共转入肠上皮细胞系hct116中，从而筛选出nf-κb和tnfα的表达抑制作用最强的mam蛋白，即cncm i 4644菌株的普拉梭菌微生物抗炎分子。

22、4、将不同剂量的cncm i 4644-mam的真核表达载体与nf-κb荧光素酶报告基因载体或炎症细胞因子tnfα启动子的荧光素酶报告基因载体共转入肠上皮细胞系hct116中，发现该普拉梭菌微生物抗炎分子在表达量很低的情况下依然具有很强的抗炎作用。

23、第六方面，本技术提供了一种普拉梭菌的分群方法，将所述的普拉梭菌微生物抗炎分子氨基酸序列进行进化树分析。

24、上述分群方法通过普拉梭菌微生物抗炎分子mam的氨基酸序列进行进化树分析，而不是传统的16srna序列，所述方法更利于筛选mam蛋白的抗炎功能。

25、第七方面，本技术提供了一种抗炎药物，所述抗炎药物包括上述普拉梭菌微生物抗炎分子。

26、在一些具体实施例中，所述普拉梭菌微生物抗炎分子的质量浓度为0.1～0.8μg/well。优选地，所述所述普拉梭菌微生物抗炎分子的质量浓度为0.1μg/well。

27、第八方面，本技术提供了普拉梭菌微生物抗炎分子在制备抗炎药物中的应用。

28、本技术的普拉梭菌微生物抗炎分子可以治疗炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征和自身免疫性肠病等肠道炎症。

29、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

30、本技术提供了一种普拉梭菌微生物抗炎分子及其筛选方法和应用。相比于faecalibacterium菌属的代表菌株a2-165的微生物抗炎分子蛋白对nf-κb信号通路和炎症因子tnfα的抑制作用分别为50％和56％，而本技术筛选出来的普拉梭菌微生物抗炎分子的抗炎作用(抑制nf-κb信号通路)可达到90％以上，具有使用剂量小，抗炎作用强的优势。并且，本技术针对临床肠道炎症治疗的常用靶点，即nf-κb信号通路和促炎因子tnfα的表达进行设计，引入荧光素酶报告基因载体这一灵敏性好、可精确定量的方法，在肠上皮细胞系上对faecalibacterium菌属的微生物抗炎分子进行筛选。最后，本技术在葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎模型中再次证明，相较于代表菌株a2-165-mam，筛选出的cncm i 4644-mam具有更明显的治疗作用。