一种用于心脏基因递送的可吸入载体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种用于心脏基因递送的可吸入载体及其制备方法与应用，属于生物医药。

背景技术：

1、心血管疾病发生在心脏和血管中，是全球第二大死亡原因。引起心血管疾病的主要原因包括冠状动脉疾病、心肌梗塞和心律失常。目前的一些治疗方法，包括传统的小分子治疗、基因治疗、细胞重编程和干细胞移植，虽然已被开发用于急性心肌梗塞后的心脏再生，但尚无有效治愈疾病的方法。更可怕的是，部分心脑血管疾病会严重影响患者的生活自理能力，目前全世界每年死于心脑血管疾病的人数超过1500万人，居各种死因首位。由此可见，开发出治疗心血管疾病的新疗法对人类健康意义非凡。

2、近年来，基因递送载体技术和基因编辑技术的快速发展推进基因治疗稳步走向临床。作为继肿瘤之后第二大基因治疗临床研究对象，心血管疾病基因疗法已呈现出巨大潜力，科研界投入了更多的精力同时也引来了资本的目光。另外，心脏基因治疗的另一个难点在于，相比其它疾病，心脏部位特殊的高速血流量会导致递送系统滞留不足，这使得现有治疗方式效果不佳，特别是在直接将功能性修复分子(如蛋白质或rna分子)递送到细胞内。因此，如何克服心脏高血流量，提高治疗基因在心脏病灶部位的蓄积是实现有效治疗的关键。

3、目前已报道的一些先进的递送系统可以诱导心脏保护或修复分子机制，包括通过反义策略进行的mirna治疗，以及腺相关病毒(aav)和脂质纳米颗粒(lnp)递送。aavs，这些基于病毒的小型载体，因其低致病性和持续基因表达而备受青睐。然而，它们面临着免疫反应、高生产成本和有限遗传物质容量等挑战。此外，aavs可以激发免疫系统产生中和抗体，从而影响治疗效果，并限制其用于重复给药。对于慢性疾病，这一点尤为棘手，因为需要持续治疗。反义策略或基于脂质的lnp方法，将遗传物质封装在脂质中作为合成载体，在毒性和脱靶效应方面存在重大问题。在严重不良事件中提出了安全担忧，包括crispr基因编辑器传递试验中的一例死亡，可能是因为需要高剂量。虽然谨慎的剂量和使用特定aav血清型可以提供组织选择性，有助于改善脱靶向效应，但在心血管治疗中，迫切需要其他更安全、更精确和更有效的递送载体，为未来在这一领域的进一步发展铺平道路。

4、另一方面，目前靶向心脏的基因递送方式包括心肌定点注射、静脉注射、冠状动脉注射、皮下注射等，其中以心肌定点注射和尾静脉注射为主。而静脉注射、皮下注射或肌内注射等方式是侵入性的，存在操作复杂、定位不准确、副作用明显等缺点，且容易导致患者不适和依从性差等问题，使得这些给药方式不适合慢性心脏病的长期治疗。因此，开发一种能够通过无创给药方式实现心脏良好药物富集的递送策略是当前心血管疾病基因治疗亟待解决的挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的是：针对目前心脏药物递送系统及给药方式存在的诸多不足及其副作用较大的技术问题，本发明提供一种用于心脏基因递送的可吸入载体及其制备方法与应用，本发明通过生物矿化策略合成了具有高生物相容性的磷酸钙纳米颗粒(cap)作为基因载体；为了提高基因在递送过程中的稳定性，通过脂质体包裹在cap的表面构建靶向基因递送系统。

2、为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种基因递送系统，包含递送载体和活性药物成分，所述递送载体为磷酸钙表面原位包裹脂质体形成的一种递送载体，所述活性药物成分为核酸药物，所述核酸药物为sirna、mrna、lncrna、rna适配体和dna中的任意一种或多种的组合。

4、核酸药物可以分为两大类：dna和rna。dna主要用于基因编辑和基因疗法等领域，而rna则分为多种类型，包括sirna(小干扰rna)、mirna(微小rna)、incrna(长非编码rna)等。

5、sirna主要用于干扰靶基因的表达，从而达到治疗与相应靶基因相关的疾病。mirna则主要作用于调控基因表达、细胞增殖和分化等生理过程，通过调节这些细胞生理功能可以达到治疗相关疾病的目的；mirna药物可帮助下调疾病相关基因活力的mirna分子和下调某些过高表达的疾病相关mirna分子的功能两方面。mirna药物治疗包括两种方式：一是通过使用mirna模拟物(mirna mimics)补充具有疾病抑制功能的mirna，二是通过mirna抑制剂(mirna inhibitors)来抑制促进疾病发生的mirna。lncrna则是一类全新的rna分子，它可以通过与dna、rna或蛋白质相互作用来调控基因的表达和蛋白质的合成，具有广泛的理论研究和应用前景。rna适配体(aptamer)是单链rna(ssrna)，具有独特三维构象，使它们能够与靶分子特异性结合。适配体可以相对容易地筛选、可重复制造、可编程设计和化学修饰，用于各种生物医学应用，包括靶向治疗。

6、优选地，所述脂质体的主要成分为dopa、脂质、胆固醇和dspe-peg；所述脂质选自1,2-双二十二碳酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dbpc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二十二酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dlpc)、1,2-花生酰磷脂酰胆碱(dapc)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酸钠盐(dppa)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)中的任意一种或多种的组合；

7、所述磷酸钙的制备原料包括氯化钙，柠檬酸钠和磷酸盐。

8、优选地，所述核酸药物为特异性靶向心脏的sirna、mrna、lncrna、rna适配体和dna中的任意一种或多种的组合，所述基因递送系统为靶向心脏的基因递送系统。

9、本发明的第二方面，提供一种上述基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：

10、步骤1：将氯化钙和柠檬酸钠溶于水中配制成混合溶液，加入核酸药物，充分混合后，得到溶液a；

11、步骤2：将磷酸盐溶于水中得溶液b，将溶液a和溶液b混合后，采用碱液调节ph至碱性下进行反应；反应结束后离心，收集固体沉淀物并洗涤，得磷酸钙基因复合物；

12、步骤3：将上述制备的磷酸钙基因复合物分散在乙醇中，加入二油酰磷脂酸钠盐(dopa)的氯仿溶液，混合均匀；然后，通过离心纯化得到dopa改性的cap纳米颗粒；

13、步骤4：将上述dopa改性的cap纳米颗粒重新分散在氯仿中，将其与脂质、胆固醇和dspe-peg混合；搅拌反应后除去氯仿，用磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)水化脂质膜，最后，通过离心纯化得脂质体包裹的磷酸钙基因复合物，即为所述的基因递送系统。

14、优选地，所述步骤2中的磷酸盐选自na2hpo4、nah2po4、k2hpo4和kh2po4的任意一种或多种的组合。

15、优选地，所述步骤2中溶液a和溶液b混合后体系中氯化钙、柠檬酸钠和磷酸盐的浓度比为5-15：20-80：10-30；所述核酸药物和氯化钙的质量摩尔比为25～250μg：5～15μmol，优选为37～125μg：5～15μmol。

16、优选地，所述溶液a和溶液b混合后体系中氯化钙的浓度为50-150mm，柠檬酸钠的浓度为200-800mm，磷酸盐的浓度100-300mm；核酸药物的浓度为25～250μg/ml，优选为37～125μg/ml。

17、优选地，所述步骤2中的碱液为naoh溶液。

18、优选地，所述步骤2中调节ph至9～11。

19、优选地，所述步骤4中脂质体的成分包括dopa、脂质、胆固醇和dspe-peg，其投料摩尔比为0.5-1.5：1-2.5：0.6-0.9：0.15-0.45。

20、优选地，所述dspe-peg的分子量为2000-10000。

21、本发明的第三方面，提供上述基因递送系统在制备用于治疗心血管疾病的药物中的应用，所述基因递送系统中的核酸药物为特异性靶向心血管疾病相关基因的sirna、mrna、lncrna、rna适配体和dna中的任意一种或多种的组合。

22、优选地，所述药物的剂型为吸入制剂，给药方式为吸入给药。

23、本发明中，所述心血管疾病包括但不限于心肌肥大，心衰，心梗和心肌炎；所述核酸药物包括但不限于心脏特异性nadph氧化酶4(nox4)sirna(sinox4)，载脂蛋白c3(apoc3)sirna(siapoc3)，生长分化因子15(gdf15)sirna(sigdf15)，mirna-30d，mirna-21，和mirna-125a-5p。

24、针对目前心脏药物递送系统及给药方式存在的诸多不足及其副作用，考虑到吸入给药操作简便、依从性好、全身不良反应相对较少等优点，本发明通过生物矿化策略合成了具有高生物相容性的磷酸钙纳米颗粒(cap)作为基因载体。为了提高基因在递送过程中的稳定性，通过脂质体包裹在cap的表面构建靶向基因递送系统。通过吸入给药后，脂质体包裹磷酸钙载体可携带负载的基因通过心肺循环在心脏内富集。实验结果表明：通过吸入给药的方式在心脏富集效果方面可以比静脉给药高3-5倍，进而有望最大程度发挥rna、dna等对于心脏纤维化和心脏重塑的缓解作用，从而实现良好的治疗作用。同时，作为代表性验证，本发明通过构建小鼠心肌肥大模型，进一步探索心脏特异性nadph氧化酶4(nox4)sirna(sinox4)递送改善心脏功能治疗心肌肥厚的可能性。动物实验结果表明：小鼠吸入给药sinox4负载的基因递送系统可显著改善心脏功能，减少纤维化和心肌细胞横截面积。本发明提供了一种启发性的非病毒心脏核酸递送方法，并为心脏疾病的治疗提供了一种具有转化潜力的递送工具。

25、本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

26、1)本发明提供了一种特异性靶向心脏的递送载体：小干扰rna(sirna)治疗被认为是治疗心脏疾病的一种强有力的治疗策略；然而，寻找一种安全有效的sirna体内递送途径是拓宽其临床应用的主要挑战；因脂质纳米颗粒(lnps)作为递送载体的发展，已经在疾病治疗方面取得了许多进展；然而，rna治疗仍然受到在肝脏以外安全、精确和高效递送的限制；因此，为了充分发挥基因医学的潜力，迫切需要具备心脏靶向递送sirna的工具或技术；本发明通过设计一种脂质体包裹磷酸钙基因递送载体，通过结构优化后形成一种可吸入式的制剂，很大程度降低了肝脏的非特异性摄取，实现了心脏的有效富集；

27、2)本发明解决了心脏递送存在的难题：心脏部位特殊的高速血流量导致药物递送系统难以在病灶有效富集，使得现有的递送系统在治疗心脏相关疾病时效果不佳；此外，目前用于治疗心脏疾病的给药方式主要包括口服或注射(静脉或心肌内)的途径；然而，在急性或慢性胃肠道充血期间，肠内吸收往往是不可靠的，而静脉、皮下或肌内注射等方式是侵入性的，存在操作复杂、定位不准确、副作用明显等缺点，容易导致患者不适和依从性差等问题，使得这些给药方式不适合慢性心脏病的长期治疗；本发明的基因递送系统通过采用吸入给药的方式，其为一种增强心脏富集的基因递送策略，通过吸入装置将制剂有效递送并富集至心脏部位发挥作用，解决了目前心血管疾病药物递送富集不足及给药方式有创的问题。