一种抗白粉病的蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及生物，更具体地说，本发明涉及一种抗白粉病的蛋白及其应用。

背景技术：

1、南瓜是葫芦科南瓜属(cucurbita l.)一年生草本植物，是我国重要的瓜类作物和蔬菜作物。南瓜主要分为中国南瓜(cucurbita moschata)、印度南瓜(cucurbita.maxima)和美洲南瓜(cucurbita pepo)三大类。随着南瓜种植面积的增大，各类病害正逐步加重。白粉病作为南瓜生产的一种主要病害，发病时会严重影响其产量和品质，对南瓜生产造成巨大的损失。

2、白粉病是一种专性活体寄生的真菌性病害。白粉病菌的种类繁多，不同作物的病原菌菌株也不尽相同，其中危害南瓜以及其他葫芦科的白粉病菌株主要是单囊壳(podosphaera)属。目前白粉病的防治依然主要依靠使用化学农药的方式，但长期使用化学杀菌剂易使病原菌产生抗药性，并会造成农药的残留和生态环境的污染。通过现代生物技术的手段，挖掘南瓜抗白粉病基因，研究分子机制，并通过基因编辑或者转基因的手段，培育抗病南瓜新品种，正成为防治白粉病的主要解决方案。

3、目前的研究表明，白粉病抗性可能是由多基因位点控制的数量性状决定，有关葫芦科白粉病抗性遗传分析和相关分子标记报道的较多，但真正克隆和鉴定抗性基因的非常匮乏。

技术实现思路

0、发明简述

1、为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种抗白粉病的蛋白及其应用。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供一种抗白粉病的蛋白，所述蛋白包括与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少98％，至少99％或至少100％同一性的氨基酸序列。

4、在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

5、本发明还提供一种白粉病抗性基因，其具有选自下述的核酸序列：

6、(1)编码所述蛋白的核酸序列或其互补序列；

7、(2)如seq id no:2所示的核酸序列或其互补序列；

8、(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列；或

9、(4)因遗传密码的简并性而与(1)或(2)所示序列编码相同蛋白的核酸序列，或其互补序列。

10、本发明还提供一种基因表达盒，其包含所述的抗性基因。

11、本发明还提供一种表达载体，其包含所述的抗性基因、或所述的基因表达盒、或表达所述的蛋白。

12、本发明还提供一种宿主细胞，其包含所述的抗性基因、或所述的基因表达盒、或所述的表达载体。

13、在一个具体实施方式中，所述宿主细胞是植物细胞。

14、本发明还提供一种培育抗白粉病转基因植物的方法，其包含将所述的基因或所述的载体转入植物中进行表达，或将所述的植物细胞再生成植物，以产生对白粉病的抗性。

15、本发明还提供通过所述方法产生的植物。

16、本发明还提供所述的蛋白或所述的抗性基因或所述的基因表达盒或如所述的表达载体在抗性育种中的应用，所述育种为选育具有白粉病抗性的植物。

17、本技术通过定位南瓜白粉病的候选基因，并进行功能验证，以期解析葫芦科抗白粉病的分子机制，并为育种提供技术支持。

18、发明详述

19、本说明书中使用的一些术语定义如下。

20、在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶植物。本发明的植物包括近交系、杂交种、开放授粉品种、双单倍体的植物或分离群体的植物。

21、在一个具体实施方式中，所述转植物为南瓜、小麦或拟南芥。

22、在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

23、“表型”指作为基因表达的表现的细胞或生物体的可检测的特征。

24、“表型性状指数”指至少两个表型性状的复合值，其中可以给每个表型性状赋予权重，以反映对选择而言的相对重要性。

25、“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由dna构成，但是rna载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、f粘粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组、合成染色体等。如本文使用的，短语“工程载体”包含用于本公开内容的核酸指导的核酸酶系统和方法中的核酸酶的编码序列。在细菌系统中，工程载体还可以包含λred重组工程系统或其等同物。工程载体通常还包含选择标记。如本文使用的，短语“编辑载体”包含供体核酸和grna编码序列，所述供体核酸任选地包括对靶序列的改变，所述改变在编辑发生后阻止核酸酶在靶序列中的pam或间隔物(spacer)处结合。编辑载体还可以包括选择标记和/或条形码。在一些实施方案中，可以将工程载体和编辑载体组合；即，工程载体的内容物可以在编辑载体上找到。此外，工程载体和编辑载体包含可操作地连接至例如核酸酶编码序列、重组工程系统编码序列(如果存在)、供体核酸、指导核酸和一种或更多种选择标记的控制序列。

26、在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

27、在本发明中，“宿主细胞”应理解为可以引入突变型蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。

28、术语"突变"是指相对于正规序列或野生型序列或参考序列，多肽中的单个氨基酸变异和/或核酸序列中的至少单个核苷酸变异。

29、术语“多核苷酸”、"核酸"、"核酸分子"或"核酸序列"可以互换使用，是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸和其片段或部分，其可以是单链或双链，并且表示有义或反义链。核酸包括dna、rna或者其杂交体，并且可以具有天然或合成来源。例如，核酸可包括mrna或cdna。核酸可包括已被扩增(例如，使用聚合酶链反应)的核酸。核苷酸名称"r"意指嘌呤例如鸟嘌呤或腺嘌呤；"y"意指嘧啶例如胞嘧啶或胸腺嘧啶(如果是rna则为尿嘧啶)；"m"意指腺嘌呤或胞嘧啶；"k"意指鸟嘌呤或胸腺嘧啶；以及"w"意指腺嘌呤或胸腺嘧啶。

30、本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。

31、术语“转基因”植物是指包含异源多核苷酸的植物。优选地，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得多核苷酸传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独整合到基因组中或作为重组表达盒的一部分整合。“转基因”在本文中用于指任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型由于异源核酸的存在而被改变，包括那些最初被改变的转基因生物体或细胞，以及从初始转基因生物体或细胞杂交或无性繁殖所产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不旨在包括通过常规植物育种方法(例如，杂交)或通过天然发生的事件(如，自体受精、随机杂交受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变基因组(染色体或染色体外)。

32、在两个核酸或多肽序列的情况下，如本文中使用的术语“序列同一性”或“同一性”可以是指在指定比较窗口上比对最大对应性时在这两个序列中相同的残基。

33、用于比较的序列比对方法是本领域技术人员熟知的，可使用从美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的blast运算法则(altschul et al.,1990,mol.biol.215:403-10)，使用默认参数确定。

34、各种程序和比对算法例如描述于smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；higgins和sharp(1988)gene 73:237-44；higgins和sharp(1989)cabios 5:151-3；corpet等人(1988)nucleicacids res.16:10881-90；huang等人(1992)comp.appl.biosci.8:155-65；pearson等人(1994)methods mol.biol.24:307-31；tatiana等人(1999)femsmicrobiol.lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项可见于例如altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-10。

35、可访问美国国家生物技术信息中心(ncbi)基本局部比对搜索工具(blasttm；altschul等人(1990))，包括美国国家生物技术信息中心(bethesda,md)、以及在互联网上，其与几种序列分析程序结合使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网的blasttm的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的blasttm(blastn)程序的“blast 2序列”功能。在用这种方法评估时，与参考序列具有较大相似性的核酸序列将显示出同一性百分比的增加。

36、本领域技术人员还清楚的是，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

37、如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的n和/或c末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型蛋白的n和/或c末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型蛋白的生物学活性。例如，突变型蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的n和/或c末端缺失了一个或多个(例如1－50个、1－25个、1－10个或1－5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。

38、术语“基因编辑”通常是指在基因组中进行dna插入、删除、修改或替换的一项技术。许多适用于在本发明的方法中使用的基因编辑系统是本领域已知的，包含但不限于锌指核酸酶(zfns)系统、转录激活样效应因子核酸酶(talen)系统和crispr/cas系统。

39、本文中使用术语是为了描述特定的实施例，不是为了设定限制。除非是文中明确特别指出的内容外，上述内容中英文版本中使用的“a”“an”和“the”也包含它们的复数形式。本文中使用的术语“组成-comprises”和/或“组成-comprising，”或“包括-includes”和/或“包括-including”特指本文中描述的特点，因素和/或成分的存在，不排除存在和追加一个或多个其他特点，因素和成分。上述内容中使用的术语“和/或”包括所有一个或多个组合清单中的项目。

40、本发明已经通过一系列实施例进行详尽的阐述，但本发明不仅限于已经揭示的实施例。符合本发明范围内的任何数量变动，替换，置换等，本文中未进行阐述，或可根据公众需要进行修改。