一种大豆多肽及其制备方法与应用

本发明涉及大豆多肽制备，具体是涉及一种大豆多肽及其制备方法与应用。

背景技术：

1、我国是大豆的生产大国，同时也是豆制品的消费大国。大豆中含有丰富的蛋白质，由于其氨基酸配比合理，常作为动物蛋白的替代品。大豆多肽是由大豆蛋白水解产生的一类化合物，平均肽链长为2～10个氨基酸残基，分子量分布通常在3000da以下。大豆多肽不仅易于消化吸收，还具有抗氧化、抗衰老、降血压、降血脂和抗疲劳等生理功能，是一类应用广泛的功能性原料。

2、大豆多肽的制备主要是以大豆分离蛋白或豆粕等为原料，应用蛋白酶在一定的温度和ph条件下酶促降解而获得。但由于商业种类不多，作用位点单一，因此催化降解产生的多肽序列往往同质化，某些功能如抗癌活性报道较少。目前，大豆多肽更多地采用发酵法制备，即筛选产蛋白酶能力强的菌株直接发酵豆粕，一方面可以降低生产成本，另一方面也可以改善多肽的风味，但以这种方法制备的多肽往往纯度不高，功效不突出。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，提供一种大豆多肽及其制备方法与应用，本技术方案解决了上述背景技术中提出的制备的多肽往往纯度不高，功效不突出的问题。

2、为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种大豆多肽及其制备方法，包括：

4、s1、原材料预处理：采用粉碎机将低温脱溶豆粕进行粉碎处理，将产物过60～80目筛，得到豆粕粉；

5、s2、酸沉与水洗：向豆粕粉当中加入水，温度升高到30～60℃，在搅拌条件下采用浓盐酸将ph调节到3.0～6.0，所述豆粕粉和水的固液比为1：8～1：12；

6、将大豆蛋白沉淀，继续搅拌1～2h，采用离心机进行处理，倾去上清；

7、按照上述固液比继续向沉淀当中加水，此时不需要升温，同时不需要调整ph值；

8、继续搅拌15～20min，对沉淀进行水洗，离心机继续进行离心，所述离心机的转速为每分钟6000～9000r，将上清液去除以后收集沉淀；

9、按照同样的操作水洗沉淀，然后弃掉上清液，收集沉淀；

10、s3、酶水解：收集酸沉与水洗步骤当中的沉淀，所述沉淀和水的固液比为1：8～1：12，将其和水进行混合、搅拌；

11、采用naoh溶液将ph调节到8.0～10.0，将温度升高到35℃～60℃；

12、按照每千克豆粕中加入40～100ml酶液的比例，向其中加入酶液，所述酶液为卡氏枯草杆菌丝氨酸碱性蛋白酶液；

13、在水解反应的进程中，向其中滴0.05mol/l的naoh，保持体系内部的ph值稳定，在蛋白质水解度为20～30％的时候，反应停止；

14、s4、酶灭活：在酶水解结束以后，将温度快速升高到90～100℃，维持10～20min，将酶灭活；

15、在10～20min内将其快速降到室温，将ph调节到中性，用离心机进行离心处理以后，所述离心机的转速为每分钟12000～15000r，固液分离，其中上清液即为大豆多肽原液；

16、s5、浓缩：从酶灭活步骤中获得过膜液，对过膜液进行减压浓缩处理，得到固型物，所述固型物的含量为35～40％；

17、s6、干燥：在浓缩结束以后，经喷雾干燥或者冷冻干燥以后，将其制作成干粉。

18、具体的制备过程如下：选取20g蛋白含量45％的大豆豆粕粉，将其与200ml的水混合、搅拌，将温度升高到45℃，采用浓盐酸将溶液的ph值调节到4.2。2h以后搅拌停止，以9000rpm离心处理30min，将上清去除，向沉淀中加入200ml的水，继续搅拌20min，继续以9000rpm离心处理30min，去除上清，继续重复该步骤。将沉淀收集，加入200ml的水，继续搅拌，加入0.5mol/l的naoh，将ph值调节到9.5，温度升高到35℃，加入1.1ml酶液，进行水解反应。在水解反应的过程中，继续保持50℃的温度，ph维持在9.5。在水解度达到了25％以后，停止反应。待反应结束以后，快速将温度升高到95℃，保持10～15min，使酶灭活。将温度降到室温，将ph调整到6.8，以12000rpm进行30min离心处理，上清液是粗制的大豆肽液。将大豆肽液过分子量是5000da超滤膜，将大分子片段去除。膜上液回到酶解罐中然后进行水解。精制大豆肽液减压并且浓缩到固形物含量35～40％，喷雾干燥获得精制的大豆肽干粉。

19、一种大豆多肽的应用，由上述制备方法制得，应用在制备保健食品或抗癌药物中。

20、实验以对胃癌细胞sgc7901的生长抑制作用作为反映抗癌活性的指标，通过初次筛选，发现大豆多肽对癌细胞的生长抑制率随加样浓度升高而升高，最高抑制率分别为44.84％、69.34％、50.32％(见图1)。根据ic50的定义，采用spss的probit计算得分子量小于5000u、5000～10000u、大于10000u三种组分的ic50值分别为1.17、0.47、0.96mg/ml。比较各组分半数致死浓度(ic50)值可知，分子量在5000～10000u的组分对癌细胞的抑制作用最佳，此时的ic50≈0.47mg/ml。因此，初步确定大豆抗癌肽的分子量范围在5000～10000u。

21、对经过膜液得到的相对分子质量在5000～10000u的多肽液进行sephadexg-75柱层析分离，分别收集洗脱峰并编号a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a9、a10(见图2)。将收集的各组分配成浓度为0.1mg/ml溶液，进行抗癌活性检测，结果见图3。

22、由图3可知，组分a1～a10中，a4的抗癌活性最高，生长抑制率ir＝33.15％＞30％，具有敏感的抗癌性。其次是组分a5，它的生长抑制率ir＝27.73％<30％，因此对癌细胞的生长抑制不敏感。抗癌活性最低的是组分a2，抑癌率只有1.17％。各组分的抗癌活性依次为a4＞a5＞a3＞a9＞a1＞a7＞a8＞a6＞a10＞a2。将a4组分配成不同浓度(0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)的溶液，根据细胞抑制率(17.58％、20.96％、30.59％、35.67％、40.2％、46.7％、45.5％、44.4％、56.3％)计算其ic50为0.37mg/ml。明显优于过膜后的抗癌肽组分(ic50≈0.47mg/ml)，说明纯化效果较好。

23、由于肽结构的复杂性，其抗癌机理也比较复杂。肽的抗癌活性一方面与其特定的氨基酸组成有关；另一方面还与其氨基酸序列有密切联系。如lunasin，其抗癌作用是因为在它的c-末端有8个天冬氨酸残基，当它们结合到核染色质区域后(比如出现在着丝点)，它们对抗有丝分裂效应起到很大的作用。结果，着丝点处复合物不能正常形成，微管不能连到着丝点上，导致有丝分裂停止，细胞最终死亡，从而起到抑制癌细胞增殖的作用。

24、按上述柱层析分离方法测定各已知分子量标准物的保留时间，记录蛋白标准品的最大吸收峰出现时的保留时间(min)，测定结果见图4，以保留时间为横坐标，以lgm为纵坐标，绘制标准曲线如图5。

25、由图5可见，分子量对数与保留时间呈线性关系，回归方程为y＝-0.0817x+6.4632，r2＝0.988。式中，x代表保留时间，y代表分子量对数，0.988为标准曲线的线性相关系数。由此可知，各分子量的对数值与各标样的保留时间具有良好的线性关系，可以准确地根据此回归方程计算出提取物中抗癌肽分子量分布。

26、大豆多肽也有易消化吸收以及吸收速度快的基本特征，使其可以作为营养剂。可以将大豆多肽用在康复期患者以及消化功能减退的老年人、消化功能未完全成熟的婴幼儿服用。在使用大豆多肽的时候可以结合辅料，制作成各种各样的食品，比如制作成老年奶粉。将大豆多肽作为基料，按照老年人的营养要求以及生理特征，添加全脂奶粉以及蜂蜜，加强必需氨基酸，即半胱氨酸以及蛋氨酸，加强ca、fe以及zn等无机盐融入到天然果汁当中，研制出高果糖和高蛋白、易消化的老年奶粉，能够显著降低老年，人的血清胆固醇，是非常优质的营养保健类食品。大豆多肽具备了反抗原性以及降低胆固醇的作用，因此能够将其用于生产具备降血压、降胆固醇以及预防心血管疾病等功能性保健食品

27、大豆多肽还具备了较好的保湿性与吸湿性，能够软化产品，改善口感。因此，能够将其用于生产各种豆制品，风味与品质俱佳，同时富有丰富的营养，容易消化吸收。用于肉、鱼等高蛋白制品，能够凸显出制品的肉类风味，提升食品香鲜度，有助于口感与品质的优化。将其用户烘焙食品，能够增加食品的香气与风味，保证食品质地疏松，比如加入面包面团当中，可以增加粘弹性，降低面包失水，保证面包具备更加柔软的质地，增大体积，增加香气。用于生产糕点、糖果、巧克力，降低产品的甜度，降低成本，显著提升蛋白质中氨基酸的含量，有助于改善口味品质，延长保质期。由于大豆多肽具备较高的水溶性，容易导致粘性较低，在酸性条件性不容易产生沉淀，并且还具备了一定的发泡作用，因此可以用于生产酸性饮料、汽水、营养饮品、速溶奶粉等食品高果糖和高蛋白、易消化的老年奶粉，能够显著降低老年。

28、与现有技术相比，本发明提供了一种大豆多肽及其制备方法与应用，具备以下有益效果：

29、本发明制备大豆多肽分子量在5000-10000u时具有最高的抑癌活性，大豆抗癌肽的ic50为0.47mg/ml。经柱层析分离后，体外细胞实验结果显示：组分a4具有最佳抗癌活性，ic50为0.37mg/ml；在0.1mg/ml浓度下，其ir值为33.15％＞30％，具有敏感的抗癌性；通过标准曲线计算大豆抗癌肽的平均相对分子质量为6723u，因此该制备方法较为简单，大豆多肽纯度较高，功效较为突出。