一种植物细胞表达工具的构建及其应用

本发明涉及合成生物学领域，尤其涉及植物细胞中表达工具的创建及应用。

背景技术：

1、植物利用二氧化碳作为碳源，能够进行光合自养。植物细胞具有丰富的次生代谢合成途径，可以产生多种前体用于复杂化合物的合成。除此以外，植物作为合成生物学底盘还具有安全性高、易于大规模培养和生产等优势。随着植物合成生物学技术的发展，越来越多的功能性治疗蛋白和活性小分子在植物底盘中成功实现了合成。合成应用中最广泛的植物底盘是烟草。它具有生长周期短，生物量大的优势。2014年，在烟草中生产了用于治疗埃博拉病毒的特效抗体药物zmapp，在临床试验中能够治好埃博拉的重病患者；此外，bxn的转基因烟草在英国被批准可以进行商业化种植；ntqpt1的转基因烟草在美国也通过了安全行验证，被商业化种植。

2、在植物细胞中以特定的模式或特定的强度控制目的基因的表达仍然具有挑战性。一个很有效的解决方案就是引入人工基因表达调控工具来实现对目的基因表达模式和表达强度的调控。合成生物学基于理性的设计，通过对元件的集成和装配，从而构建出具有特定功能的人工核酸/蛋白序列工具。人工合成的表达调控工具在微生物细胞中已经表现出了比天然基因序列更优越、更可控的功能性状。一个高活性的基因表达工具有助于提高植物细胞中生产功能活性蛋白的经济效益，促进植物底盘的商业化应用。

3、植物较长的生长周期是这些遗传工具难以广泛应用的一个重要原因。如果需要根据输出结果再回来调整序列结构和活性更是会耗费很长的时间。因此，本领域仍需要使用方便的烟草叶片中农杆菌介导的瞬时转化法以便定量分析。

技术实现思路

1、基于上述缺陷，本发明提供一种人工转录激活表达工具，能提高植物细胞中目的蛋白的表达。

2、本发明第一方面提供一种嵌合启动子，包含蛋白结合区域以及核心启动子序列。

3、在一个或多个实施方案中，所述蛋白结合区域是结合激活蛋白的核苷酸区域。

4、在一个或多个实施方案中，所述蛋白结合区域包含1-8个串联重复的seq id no:1第1-36位所示的序列。优选地，重复个数为5和/或6。

5、在一个或多个实施方案中，所述核心启动子序列包含act2核心启动子序列，优选包含拟南芥的act2核心启动子序列。在一个或多个实施方案中，所述核心启动子元件如是拟南芥的act2启动子的包含seq id no:1第43-243位所示序列的片段。所述片段为200-1000bp，优选200-500bp。

6、在一个或多个实施方案中，所述蛋白结合区域和核心启动子序列直接连接或通过接头操作性连接。

7、在一个或多个实施方案中，所述蛋白结合区域位于核心启动子序列上游。

8、在一个或多个实施方案中，所述蛋白结合区域与核心启动子序列距离为0-300nt，优选为0-216nt。

9、在一个或多个实施方案中，所述嵌合启动子序列具有seq id no:1-8任一所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:1-8的蛋白结合功能的变体。

10、本发明第二方面提供一种融合蛋白，包含核酸结合结构域以及转录激活结构域，所述核酸结合结构域是能与核酸结合的蛋白或结构域，包括lexa结合蛋白或其含有lexa识别结构域的肽段。

11、在一个或多个实施方案中，所述核酸结合结构域具有seq id no:9第1-87位氨基酸序列或与其有至少90％序列相同性并保留核酸识别功能的同源序列。所述同源序列来自肠杆菌科，或来自埃希氏菌属。

12、在一个或多个实施方案中，所述转录激活结构域选自vp16、dell、erf2、med2、p300、tv、vp64、vpr中的一种或多种；优选为vpr或tv；更优选为vpr。

13、在一个或多个实施方案中，所述核酸结合结构域和转录激活结构域直接连接或通过接头肽连接。所述接头肽是由1-5个氨基酸g和1-5个氨基酸s组成的单元的重复序列，优选为ggggsn，n＝1-4，优选n为1。

14、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括核定位信号(nls)，优选为植物细胞核定位信号氨基酸序列。在一个或多个实施方案中，所述核定位信号的序列如seq idno:10第1-8位所示。

15、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白具有seq id no:9-17任一所示的序列或与其有至少90％序列相同性并保留seq id no:9-17的功能的变体。

16、本发明还提供一种核酸构建物，包含(1)本文任一实施方案所述嵌合启动子和(2)本文任一实施方案所述融合蛋白的编码序列。

17、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，优选非病毒载体，更优选适于在植物中复制、转录和/或表达的载体。

18、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。

19、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含第一表达框和第二表达框，第一表达框包含所述融合蛋白的编码序列，第二表达框包含所述嵌合启动子。

20、在一个或多个实施方案中，所述第一表达框和第二表达框位于同一载体上或不同载体上。

21、在一个或多个实施方案中，所述第一表达框包含所述融合蛋白的编码序列，位于融合蛋白上游的启动子，及位于融合蛋白下游的终止子。

22、在一个或多个实施方案中，所述第一表达框中融合蛋白的启动子是适合在植物中启动表达的启动子，例如选自p_stubi、p_mas、p_atrbcs1、p_csvmv、p_ocs、p_rbc。所述启动子的序列分别如seq id no:18-23所示。

23、在一个或多个实施方案中，所述第一表达框中的终止子是能在植物中终止表达的终止子。所述终止子选自t_athsp、t_rbcs1、t_mas、t_atact2、t_ubq和t_35s。优选地，所述终止子序列如seq id no:29所示。

24、在一个或多个实施方案中，所述第二表达框还包含位于嵌合启动子下游的用于插入外源序列的区域，例如克隆位点。

25、在一个或多个实施方案中，所述第二表达框还包含位于嵌合启动子下游的终止子。所述终止子选自t_athsp、t_rbcs1、t_mas、t_atact2、t_ubq和t_35s。优选地，所述终止子序列如seq id no:24所示。

26、在一个或多个实施方案中，所述第二表达框还包含目标蛋白的编码序列，所述目标蛋白的编码序列由所述嵌合启动子启动表达。所述目标蛋白的编码序列位于嵌合启动子下游。

27、在一个或多个实施方案中，所述目标蛋白的编码序列位于克隆位点中。优选地，所述目标蛋白的编码序列包含选自egfp蛋白、西尼罗河病毒ns1蛋白、寨卡病毒ns1蛋白、奇果蛋白(miraculin)中的一种或多种蛋白的编码序列。

28、在一个或多个实施方案中，所述第二表达框包含所述嵌合启动子，克隆位点，及位于克隆位点下游的终止子序列。

29、在一个或多个实施方案中，所述第二表达框包含所述嵌合启动子，目标蛋白编码序列，及位于目标蛋白下游的终止子序列。

30、本发明还提供一种宿主细胞，包含：

31、(1)本文任一实施方案融合蛋白和具有本文任一实施方案嵌合启动子的表达框，或，

32、(2)本文任一实施方案所述的核酸构建物。

33、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌。

34、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞不是植物细胞。

35、本发明还提供一种试剂盒，包含本文任一实施方案所述的嵌合启动子、融合蛋白、核酸构建物、和/或宿主细胞。

36、本发明还提供一种在细胞中表达目标蛋白的方法，所述细胞包含：(1)本文任一实施方案融合蛋白和(2)具有本文任一实施方案嵌合启动子的表达框，所述目标蛋白的编码序列与所述嵌合启动子操作性连接，所述方法包括在所述融合蛋白诱导嵌合启动子启动表达的条件下孵育所述细胞的步骤。在一个或多个实施方案中，所述条件是适合所述细胞生长的条件。

37、在一个或多个实施方案中，所述细胞包含本文所述的核酸构建物。

38、在一个或多个实施方案中，所述方法包括：(1)将目标蛋白的编码序列导入本文所述核酸构建物中，所述目标蛋白的编码序列由所述嵌合启动子启动表达；(2)将所述核酸构建物转移到细胞中；(3)在适合所述核酸构建物表达的条件下孵育所述细胞。在一个或多个实施方案中，所述目标蛋白的编码序列导入第二表达框中的嵌合启动子下游，优选地，导入嵌合启动子下游的克隆位点中。在一个或多个实施方案中，所述适合所述核酸构建物表达的条件是第一表达框表达并且所表达的融合蛋白能诱导嵌合启动子启动目标核酸表达的条件。在一个或多个实施方案中，所述条件是适合细胞生长的条件。

39、在一个或多个实施方案中，所述方法包括：(1)将目标蛋白的编码序列导入包含本文任一实施方案所述的嵌合启动子的第二表达框中，位于嵌合启动子的下游，(2)将第二表达框导入细胞中，所述细胞包含本文任一实施方案的融合蛋白或含有第一表达框，所述第一表达框包含本文任一实施方案所述的融合蛋白的编码序列；(3)在适合第二表达框表达的条件下孵育所述细胞。在一个或多个实施方案中，所述第二表达框还包含终止子和任选的克隆位点。在一个或多个实施方案中，所述目标蛋白的编码序列位于克隆位点中。在一个或多个实施方案中，所述适合第二表达框表达的条件是融合蛋白能诱导嵌合启动子启动表达的条件，或者，是第一表达框表达并且所表达的融合蛋白能诱导嵌合启动子启动目标蛋白的编码序列表达的条件。在一个或多个实施方案中，所述条件是适合细胞生长的条件。

40、在一个或多个实施方案中，所述目标蛋白的编码序列包含选自egfp蛋白、西尼罗河病毒ns1蛋白、寨卡病毒ns1蛋白、奇果蛋白(miraculin)中的一种或多种蛋白的编码序列。

41、在一个或多个实施方案中，所述细胞是植物细胞。

42、本发明还提供一种获取表达目标蛋白的植物的方法，包括：

43、(1)将包含目标蛋白的编码序列的本文所述的核酸构建物转入植物器官或组织，获得转化有所述核酸构建物的植物组织或器官，所述目标蛋白的编码序列由所述嵌合启动子启动表达；和

44、(2)将步骤(1)获得的转入了本文所述核酸构建物的植物组织或器官再生成植物植株。

45、在一个或多个实施方案中，所述目标蛋白的编码序列位于所述第二表达框中，由所述嵌合启动子启动表达。

46、优选地，所述的方法包括步骤：

47、(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明所述核酸构建物；

48、(2)将植物组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述目标蛋白的编码序列转入并且整合到植物细胞的染色体上；

49、(3)选择出转入所述目标蛋白的编码序列的植物组织或器官；以及

50、(4)将步骤(3)中的植物组织或器官再生成植物。

51、本发明通过在植物细胞中引入人工启动子核苷酸序列以及人工激活融合蛋白，利用激活转录回路提高了植物细胞中内源、外源蛋白的表达，实现了天然启动子不能实现的目标基因的表达模式和强度，有助于提高植物细胞中生产功能活性蛋白的经济效益，促进植物底盘的商业化应用。