肝脏疾病的检测的制作方法

本发明涉及非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, nash）的检测方法及相关方法和试剂盒。

背景技术：

1、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, nafld）涵盖从单纯性良性肝脏脂肪变性至非酒精性脂肪性肝炎（nash）的全组织学谱，所述非酒精性脂肪性肝炎（nash）的特征是脂质蓄积、炎症、肝细胞气球样变（ballooning）和不同程度的纤维化。nash可进展为肝硬化或肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, hcc）。nash与非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver, nafl）不同，其具有最大的潜力进展为肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。nafld的患病率正在增加，并与肥胖病例的增加有关。尽管对于肥胖相关肝病的认知正在增长，但对nafld和nash的发病机制仍然知之甚少。

2、基于nafld的患病率，预计未来nash诱导的肝硬化将成为肝移植最常见的适应症。区分nash与单纯性脂肪变性对于nafld患者的临床管理和降低死亡率非常重要(chen等人.radiology. 2011 jun；259(3):749-756)。

3、唯一被批准用于nash的诊断的测试是肝脏活检，这是一种可能导致并发症的侵入性手术。替代的方法在nash早期和整体缺乏足够的性能，这限制了nash的早期检出，并导致难以评估实验药物的疗效。因此，需要替代的诊断测试，特别是能够诊断nash并区分nash与nafld的其他分期即nafl的测试。nafld和nash的非侵入性的鉴别将有助于显著降低与这些病理的诊断相关的风险。区分nash和nafl促使更早的生活方式改变、医疗干预、癌症筛查，以及总体上改善的结局。

4、外源性挥发性有机化合物（evoc®）探针用于诱导的挥发组学（volatolomics）-通过监测呼出的气体来监测外源性化合物的代谢过程-来检测肝脏疾病已在wo2019220145中描述。本文所述的探针用于nash的检测、诊断、分期、监测和预后的用途为nash提供了替代的测试方法。

技术实现思路

1、发明人已经证明，nash诱导的的代谢变化是使用evoc探针可检测的，所述evoc探针对于人类消费是安全的，并且在施用后与其生物产物一起出现在呼吸中。这些数据表明，使用evoc探针进行诱导的挥发组学的呼吸分析可用于nash检测测试，以及筛查、诊断、分期、监测和预后。

2、以这个方法，施用后，在呼吸气体中测量出现在受试者呼出的气体中并由肝脏代谢的一种或多种目标化合物。在受试者呼吸中一种或多种化合物(compound(s))的量取决于施用后肝脏清除化合物的效率。因此，呼吸量代表肝功能。挥发性生物产物可被替代地或额外地检测，以提高诊断的准确性。因此，呼吸中化合物的量可被用作在nash中肝功能受影响的指标。

3、因此，本发明人已经开发了一种非侵入性测试，用于检测和分期进展到非酒精性脂肪性肝炎（nash）分期的非酒精性脂肪性肝病（nafld），以在患有或疑似患有肝病的受试者中检测、诊断、分期、监测和预后（即，有进展到更晚期肝病分期的风险）。

4、因此，在第一方面，本发明涉及一种用于在受试者中检测或预后nash的方法，所述方法包括在从所述受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是普遍认为安全的（gras）化合物，其中所述酶为醛酮还原酶（akr）或醇脱氢酶或细胞色素p450（cyp）或醛脱氢酶或甘氨酸n-酰基转移酶。

5、该方法进一步包括确定nash的分期，其中nash分期选自无纤维化nash、具有纤维化的nash、具有肝细胞癌（hcc） 的nash或具有肝硬化如失代偿期的肝硬化的nash。

6、在一个实施方案中，所述酶是醛酮还原酶（akr）。

7、在一个实施方案中，所述akr是akr家族1成员。

8、在一个实施方案中，所述akr是akr1b10。在一个实施方案中，所述底物选自醛和/或醇。

9、在一个实施方案中，所述底物是壬醛和/或所述代谢物是壬醇。

10、在一个实施方案中，所述底物是1-壬醛和/或所述代谢物是1-壬醇。

11、在一个实施方案中，所述底物是反式-2-己烯醛和/或所述代谢物是反式-2-己醇。

12、在一个实施方案中，其中所述底物是己醛和/或所述代谢物是己醇。

13、在一个实施方案中，所述底物是苯甲醛和/或所述代谢物是苯甲醇。

14、在一个实施方案中，所述底物是柠檬醛和/或所述代谢物是橙花醇。

15、在一个实施方案中，所述酶是醇脱氢酶。

16、在一个实施方案中，所述底物是丁醇和/或所述代谢物是丁酮。

17、在一个实施方案中，所述底物是2-丁醇和/或所述代谢物是2-丁酮。

18、在一个实施方案中，所述底物是2-戊酮。

19、在一个实施方案中，所述底物是2-戊酮和/或所述代谢物是2-戊醇、3-羟基-2-戊酮或2,3-戊二醇。

20、在一个实施方案中，所述底物是苯甲醇且所述代谢物是苯甲醛和/或苯甲酸。

21、在一个实施方案中，所述酶是醛脱氢酶。

22、在一个实施方案中，所述底物是苯甲醛且所述代谢物是苯甲酸。

23、在一个实施方案中，所述酶是细胞色素p450（cyp）。

24、在一个实施方案中，所述cyp是cyp1a1、cyp1a2、cyp1 b1、cyp2、cyp2a6、cyp2a7、cyp2a13、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9、cyp2c18、cyp2c19、cyp2d6、cyp2e1、cyp2f1、cyp2j2、cyp2r1、cyp2s1、cyp2u1、cyp2w1、cyp3、cyp3a4、cyp3a5、cyp3a7或cyp3a43。在一个实施方案中，所述酶是cyp2c19、cyp2c9和/或cyp3a4。

25、在一个实施方案中，所述底物是2-丁酮且所述代谢物是3-羟基-2-丁酮和/或2,3-丁二醇。

26、在一个实施方案中，所述底物是2-戊酮且所述代谢物是2,3-戊二醇。

27、在一个实施方案中，所述酶是甘氨酸n -酰基转移酶。

28、在一个实施方案中，所述底物是苯甲酸且所述代谢物是马尿酸。

29、在一个实施方案中，所述底物被标记，例如用12c、13c、14c、2h、14n或18o标记。

30、在一个实施方案中，所述底物未被标记。

31、在一个实施方案中，所述生物样品选自呼吸气体、尿液、血液、血清和/或组织。

32、在一个实施方案中，所述方法包含基于在所述测试受试者中的所述底物或代谢物的浓度建立测试受试者值。

33、在一个实施方案中，测试受试者值与一个或多个参考值比较，其中测试受试者值与参考值的差异表明nash的可能性。

34、在一个实施方案中，所述参考值是已被诊断为患有nash的受试者的值。

35、在一个实施方案中，所述参考值是已被诊断为患有非酒精性脂肪性肝病（nafld）的受试者的值。

36、在一个实施方案中，所述参考值是患有已进展为失代偿期的肝硬化和/或hcc的nash受试者的值。

37、在一个实施方案中，所述参考值是健康受试者的值。

38、在一个实施方案中，测量酶的两种或多种外源性底物的浓度和/或两种或多种代谢物的浓度。

39、在一个实施方案中，受试者已被施用所述酶的外源性底物。

40、在一个实施方案中，测量代谢物的浓度。

41、在另一方面，本发明涉及一种用于确定治疗效果的方法，包括在被诊断为具有nash的受试者中，通过在从所述受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度来评估所述酶的活性，其中所述受试者已接受nash治疗，并且其中所述酶为醛酮还原酶（akr）或醇脱氢酶或细胞色素p450（cyp）。

42、在一个实施方案中，该方法包括分析在第一时间点从所述受试者获得的第一生物样品，然后分析在一个或多个另外的时间点从所述受试者获得的一个或多个另外的生物样品或其比率。

43、在一个实施方案中，所述nash的治疗是胃旁路手术和/或基于药物的治疗，所述基于药物的治疗包括至少一种药物的施用。

44、在一个实施方案中，所述nash的治疗是胃旁路手术和/或基于药物的治疗，所述基于药物的治疗包括至少一种药物的施用，所述至少一种药物选自他汀类药物、肠促胰岛素类似物、二甲双胍、利莫那班、噻唑烷二酮类和奥利司他。

45、在另一方面，本发明涉及一种用于监测受试者中nash进展或消退的方法，所述方法包括在从受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是普遍认为安全的（gras）化合物，并且其中所述酶为醛酮还原酶（akr）或醇脱氢酶或细胞色素p450（cyp）。

46、在另一方面，本发明涉及用于nash的检测或预后的试剂盒，所述试剂盒包括酶的底物和/或所述底物的代谢物和用于从患者捕获生物样品的装置。

47、在一个实施方案中，所述底物和/或代谢物选自壬醛、丁醇、反式-2-己烯醛、己醛、苯甲醛、柠檬醛、壬醇、丁酮、反式-2-己烯醇、己醇、苯甲醇、橙花醇、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇、苯甲酸、马尿酸、2-戊酮和2,3-戊二醇。

48、在另一方面，本发明涉及酶的外源性底物和/或代谢物在检测或预后nash的方法中的用途，所述酶的活性或表达在nash中上调或下调，其中所述底物选自壬醛、丁醇、反式-2-己烯醛、己醛、柠檬醛、苯甲酸、丁酮和2-戊酮，所述代谢物选自壬醇、丁酮、反式-2-己烯醇、己醇、苯甲醇、橙花醇、2-戊酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇，马尿酸和2,3-戊二醇。

49、在另一方面，本发明涉及壬醛、丁醇、反式2-己烯醛、己醛、苯甲醛、柠檬醛、2-戊酮、壬醇、丁酮、反式-2-己烯醇、己醇、苯甲醇、橙花醇、2-戊醇、苯甲酸、马尿酸、2,3-丁二醇、3-羟基-2-戊酮和/或2,3-戊二醇用于在体内检测或预后受试者中nash的方法，所述方法包括在从所述受试者获得的生物样品中测量以下各项的浓度：壬醛、丁醇、反式-2-己烯醛、己醛、苯甲醛、柠檬醛、2-戊酮、壬醇、丁酮、反式-2-己烯醇、己醇、苯甲醇、橙花醇、2-戊醇、苯甲酸、马尿酸、2,3-丁二醇、3-羟基-2-戊酮和/或2,3-戊二醇。

50、在另一方面，本发明涉及壬醛、丁醇、反式-2-己烯醛、己醛、苯甲醛、柠檬醛、2-戊酮、壬醇、丁酮、反式-2-己烯醇、己醇、苯甲醇、橙花醇、2-戊醇、苯甲酸、马尿酸、2,3-丁二醇、3-羟基-2-戊酮和/或2,3-戊二醇作为用于nash检测、分期（即评估nash分期）、诊断、监测和进展的生物标志物的用途。

51、在另一方面，本发明涉及一种在受试者中区分nash和nafld其他分期的方法，所述方法包括在从受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是普遍认为安全的（gras）化合物。

52、在一个实施方案中，所述酶的活性或表达在nash中上调或下调。

53、在一个实施方案中，所述酶是醛酮还原酶（akr）或醇脱氢酶或细胞色素p450（cyp）。

54、在另一方面，本发明涉及一种用于在受试者中检测或预后早期非酒精性脂肪性肝炎（nash）的方法，所述方法包括在从所述受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是普遍认为安全的（gras）化合物。在一个实施方案中，所述酶的活性或表达在nash中上调或下调。在一个实施方案中，所述酶是醛酮还原酶（akr）或醇脱氢酶或细胞色素p450（cyp）。

55、在另一方面，本发明涉及确定受试者中nash分期的方法，所述方法包括在从受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是普遍认为安全的（gras）化合物。在一个实施方案中，所述酶的活性或表达在nash中上调或下调。

56、在一个实施方案中，所述酶是醛酮还原酶（akr）或醇脱氢酶或细胞色素p450（cyp）。

57、在本发明的另一方面，本发明涉及确定受试者中nash分期的方法，所述方法包括在从受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是普遍认为安全的（gras）化合物。

58、在一个实施方案中，所述酶的活性或表达在nash中上调或下调。

59、在一个实施方案中，所述酶是醛酮还原酶（akr）或醇脱氢酶或细胞色素p450（cyp）。

60、因此，在另一方面，本发明涉及用于在受试者中检测或预后nash、在受试者中检测或预后早期nash、在受试者中确定nash分期、在受试者中监测nash进展或消退或在受试者中区分nash和nafld的其他分期的方法，包括在从所述受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是普遍认为安全的（gras）化合物，其中所述酶不是cyp酶。

61、在另一方面，本发明涉及用于在受试者中检测或预后nash、在受试者中检测或预后早期nash、在受试者中确定nash分期、在受试者中监测nash的进展或消退或在受试者中区分nash和nafld的其他分期的方法，包括在从所述受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度，其中所述底物是公认为安全的（gras）化合物，其中所述底物不是柠檬烯。

62、在另一方面，本发明涉及一种用于确定治疗效果的方法，包括在被诊断为具有nash的受试者中，通过在从受试者获得的生物样品中测量酶的外源性底物的浓度和/或测量所述底物的代谢物的浓度来评估所述酶的活性，其中所述酶不是cyp酶或其中所述底物不是柠檬烯。

63、在以上所有方面中，底物和/或代谢物的组合可以被用作如下进一步解释的。