一种基于Sanger测序检测遗传性白化病的方法

【】本发明涉及白化病检测领域，尤其涉及一种基于sanger测序检测遗传性白化病的方法。

背景技术

0、背景技术：

1、白化病又称眼皮肤白化病、泛发性白化病、白斑病、先天性色素缺乏，是一种常染色体隐性遗传性皮肤病，表现为皮肤、毛发、眼睛的部分或完全的色素缺失，本病有遗传异质性，与黑素形成及转运相关的多种基因均可导致疾病表型的发生。

2、泛发性白化病分为7型：oca1型又分为两个亚型，oca1a和oca1b。两亚型在出生时不能区分，二者均有tyr(tyrosinase酪氨酸酶)基因的突变，导致酪氨酸酶活性改变，引起临床表型的发生，但oca1a酪氨酸酶活性完全缺失，眼睛、皮肤完全缺乏黑色素。oca1b酪氨酸酶活性显著下降，但没有缺失；oca2型由oca2基因突变产生，该基因编码黑素小体膜上的转运蛋白。此型随年龄增长色素增加，故又称不完全性白化病；oca3型是位于9号染色体的酪氨酸相关蛋白1基因(trp1)突变导致，仅见于黑种人，产生褐色色素，故头发、皮肤为浅褐色或褐色；oca4突变基因为matp(slc45a2)，编码影响黑素合成的转运蛋白；oca5突变基因定位区域为4q24；oca6突变基因为slc24a5，属于钾离子依赖的钠钙交换蛋白的一种；oca7突变基因为c10orf11，编码富含亮氨酸重复单位的蛋白，影响黑素细胞的分化。眼白化病为x连锁遗传病，定位基因为gpr143，产物oa1是一种g蛋白受体，介导细胞间的物质运输和信号转导，其功能障碍引起黑素小体生长失控，诱发病变。人群中发病率为5/10万～10/10万，以有色人种居多，非洲一些国家发病率可以达到1:1400，中国人群发病率约为1:18000。

3、oca是各类白化病中最常见的类型，发病率超过90％。oca是由酪氨酸酶基因(tyr(nm_000372.4))突变导致酪氨酸酶功能底下或缺乏引起的oca类型。在黑色素细胞中表达的酪氨酸酶为i型跨膜蛋白，是黑色素合成的限速酶。目前已发现的该基因上存在300多个突变位点。

4、本研究拟构建一套使用二代测序技术对白化病致病基因进行筛查，再结合一代测序技术对可疑致病突变进行验证和家系连锁分析的遗传学诊断方案。

技术实现思路

0、技术实现要素：

1、本发明目的在于构建一套使用二代测序技术对白化病致病基因进行筛查，再结合一代测序技术对可疑致病突变进行验证和家系连锁分析的遗传学诊断方案，而提供一种基于sanger测序检测遗传性白化病的方法。

2、本发明是通过以下技术方案来实现的：一种基于sanger测序检测遗传性白化病的方法，包括如下步骤：

3、s1、获取白化病患者及其无类似症状父母的外周静脉血液样本，每人样本采集量为2ml，用edta.k2抗凝剂抗凝；

4、s2、患者dna采用全外显子测序进行基因检测，针对tyr基因的两个突变位点c.440c>g:p.s147*与c.1366+3a>t，应用premier3软件进行引物设计合成；

5、s3、应用sanger测序对患者和父母进行突变位点验证：反应体系为50μl,包括10×pcr缓冲液5μl，10mmol/l dntps1μl，taqdna聚合酶0.5μl，pcr正向和反向引物(100ng/μl)各1.25μl和2.5μl，dna模板(100ng/μl)，pcr反应程序：95℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次循环，最后72℃延伸7min，结束后4℃保存，pcr扩增后，取pcr反应产物5μl经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察产物特异性，扩增产物经dna纯化试剂盒纯化，进行sanger测序；

6、s4、测序结果用mutation surveyorv3.97和chromas软件进行分析；

7、s5、分析获得结果为：基于sanger测序验证患者c.1366+3a>t突变源于母方，c.440c>g:p.s147*突变源于父方。

8、进一步地，针对s2的两个突变位点，设计具体引物为：

9、tyr(nm_000372.4)；c.440c>g:p.s147*位点引物：

10、左引物：5’-ggaccaaactgcacagagag-3’，

11、右引物：5’-atcccgccagtcccaatatg-3’；

12、tyr(nm_000372.4)；(nm_000372.4)；c.1366+3a>t位点引物：

13、左引物：5’-aatgcacccattggacataacc-3’，

14、右引物：5’-tgccatgtacaaaatggcctatg-3’。

15、进一步地，s4中用mutation surveyorv3.97和chromas软件进行分析具体为：二代测序中变异结果参考dbsnp数据库、hapmap数据库、千人基因组数据库，两位点变异频率均少于0.01的变异视为可疑突变，进一步对hgmd数据库和近10年的文献进行检索，证实患儿所携带的tyr:c.1366+3a>t为已知致病突变，c.440c>g:p.s147*为新型的突变类型，因此对其进行致病性预测，应用shit和polyphen-2和软件预测突变的致病性。

16、本发明的有益效果在于：

17、本发明使用设计的引物，采用sanger测序的方法对该病例的家系进行详细的tyr基因突变检测，确定两个突变为患者白化病的遗传因素，对两个可疑致病位点进行sanger测序验证，患者病因最终得到确诊，并确认父母双方为tyr基因的杂合突变携带者，为家系的遗传咨询及产前诊断提供理论基础，为日后白化病的遗传咨询和产前诊断增添新的致病位点，为白化病的基因检测提供一种方法。

技术特征：

1.一种基于sanger测序检测遗传性白化病的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于sanger测序检测遗传性白化病的方法，其特征在于，针对s2的两个突变位点，设计具体引物为：

3.根据权利要求1所述的一种基于sanger测序检测遗传性白化病的方法，其特征在于，s4中用mutation surveyorv3.97和chromas软件进行分析具体为：二代测序中变异结果参考dbsnp数据库、hapmap数据库、千人基因组数据库，两位点变异频率均少于0.01的变异视为可疑突变，进一步对hgmd数据库和近10年的文献进行检索，证实患儿所携带的tyr:c.1366+3a>t为已知致病突变，c.440c>g:p.s147*为新型的突变类型，因此对其进行致病性预测，应用shit和polyphen-2和软件预测突变的致病性。

技术总结本发明提供了一种基于Sanger测序检测遗传性白化病的方法，采用二代测序方法对患者进行全外显子测序，筛选出TYR基因两个可疑突变位点，采用一代测序技术在患者父母外周血DNA进行Sanger测序验证，并应用生物信息学SIFT和Polyphen‑2等功能预测软件进行蛋白功能预测，本发明的有益效果在于：本发明使用设计的引物，采用Sanger测序的方法对该病例的家系进行详细的TYR基因突变检测，确定两个突变为患者白化病的遗传因素，对两个可疑致病位点进行Sanger测序验证，患者病因最终得到确诊，并确认父母双方为TYR基因的杂合突变携带者，为家系的遗传咨询及产前诊断提供理论基础，为日后白化病的遗传咨询和产前诊断增添新的致病位点，为白化病的基因检测提供一种方法。技术研发人员：叶燕绸,黎伟豪,黄秀静受保护的技术使用者：中山大学附属第七医院（深圳）技术研发日：技术公布日：2024/6/18