一种茎环引物、反转录引物设计方法及多重检测方法与流程

本发明属于多重检测，尤其涉及一种茎环引物、反转录引物设计方法及多重检测方法。

背景技术：

1、microrna是一类在真核生物中广泛存在的长度约为22个核苷酸的短链非编码rna，mirna在转录后调控基因的表达，是真核生物体内一类重要的调控因子。目前的研究显示，mirna最初是由dna转录而来，形成pri-mirna，长度大约为300～1000个碱基；pri-mirna经过一次加工后，成为pre-mirna即microrna前体，长度大约为70～90个碱基；pre-mirna再经过dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟mirna。成熟体的mirna与特定的信使rna(mrna)结合，从而抑制转录后的基因表达。mirna几乎参与了生物体细胞的每一个过程。在生物体的生长发育、细胞增殖、凋亡和衰老生物学过程中发挥重要作用，并与癌症、心血管疾病、老年痴呆症、糖尿病、胃病、肾病及急性传染病等多种疾病的发生、发展密切相关。

2、基于mirna在生物体内的重要作用和人体多种疾病的密切关系，检测mirna的表达丰度，对疾病的诊断和治疗具有一定的意义。目前mirna检测的主要方法有rna测序、芯片杂交和rt-qpcr。测序法和芯片杂交法的优势分别在于发现新颖的mirna，或寻找与疾病相关的差异表达mirna，适合高通量的mirna分析，但检测成本较高、周期长，不适合常规使用。与测序法和芯片杂交法相比，实时荧光定量pcr具有更高的检测灵敏度，能够检测低丰度表达的mirna，也常用于前两种方法鉴定筛选的mirna表达谱结果的验证。因此对诊断领域而言，最具潜力和方便有效的方法仍是金标准的rt-qpcr。

3、mirna的定量pcr检测中，由于mirna较短的序列长度(22nt左右)，pcr检测引物的长度通常为15-30nt，因此无法按照常规方法根据检测靶标的序列设计引物直接用于检测，因此在mirna反转录中通过一些特定方法增加cdna的序列长度，从而有助于下游pcr的检测。mirna的反转录目前有2种方法：加尾法和茎环法。

4、加尾法可以在poly(a)聚合酶作用下将样本中所有的mirna3’末端加入poly a增加了产物的长度，然后在oligo(dt)引物和反转录酶作用下完成对样本中全部mirna的反转录，从而实现了全部mirna的高通量反转录，一次反转录产物可以检测多种mirna，但是加尾法的灵敏度和特异性相较于茎环法较差，无法检测表达丰度低的mirna，不能有效区分序列差异小的同源mirna。

5、茎环法由于茎环引物独特的结构以及与成熟mirna的3’端互补配对序列保证了茎环法的特异性，能够避免与pre-mirna(mirna前体)退火结合，有研究显示茎环法能够有效区分低至1个碱基差异的同源mirna。检测精确性能够从低至25pg的总rna中检测到大多数的mirna，结合taqman荧光探针可以检测到低至7个拷贝数mirna分子，在拷贝数为107-100数量级范围内具有宽广的线性检测范围。因此茎环法相较于加polya法具有更高的检测灵敏度和特异性。但是由于茎环引物的特异性以及茎环引物的设计复杂性，通常一次反转录只能反转录、检测一个mirna，对于多种mirna的检测需要分别反转录检测，并且耗费的试剂成本和实验时间均会成倍增加，因此难以实现高通量的mirna检测。

6、理论上茎环法多重反转录和多重检测方法可以通过设计不同的茎环引物，每种mirna对应一种茎环引物，不同mirna的探针序列来自对应不同茎环引物的序列，从而实现了mirna的多重检测，但是不同的茎环引物可能导致反转录效率的不同进而导致检测结果的差异。设计反转录效率较为一致序列不同的茎环引物较为复杂，难以实现。

7、总之，尽管茎环法在特异性和灵敏度方面具有明显优势，但现有技术在应用于多重mirna检测时面临显著的限制。由于每种mirna需要特定的茎环引物进行反转录，设计具有一致反转录效率的不同茎环引物十分困难，这导致了实验设计的复杂性、成本的增加和实验周期的延长。此外，不同茎环引物可能存在反转录效率的差异，这将直接影响qpcr的检测准确性。

8、因此，尽管mirna在疾病诊断和治疗中具有巨大的潜力，但现有的技术在实现高通量、高灵敏度以及高特异性的mirna检测方面仍存在明显的不足。这些限制凸显了迫切需要开发一种能够克服现有技术缺陷的新方法，以提高mirna检测的准确性和效率，满足生物医学研究和临床应用的需求。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种茎环引物，所述茎环引物的核苷酸序列如seqid no.1所示。

2、此外，为解决上述问题，本发明还提供一种反转录引物设计方法，针对于每个目标mirna，设计对应的mirna反转录引物组；

3、所述mirna反转录引物组中，包括：基于上述所述茎环引物设计的特异性茎环引物、外延长引物、外延正向引物、外延探针和通用反向引物。

4、优选地，所述特异性茎环引物中包括如上述所述茎环引物的核苷酸序列，以及与所述目标mirna对应的识别序列。

5、优选地，所述外延长引物中，包括5’端延伸序列、连接序列、探针序列和3’端靶标序列。

6、优选地，所述5’端延伸序列基于引物设计原则设计且与所有的目标mirna的基因序列不同；

7、优选地，所述5’端延伸序列的长度为18-26个核苷酸。

8、优选地，所述连接序列是由t、c和a三种碱基组成的序列片段；

9、所述连接序列的长度为4-6个核苷酸；

10、优选地，所述连接序列长度为4个核苷酸；

11、优选地，所述连接序列为ttca。

12、优选地，所述外延探针序列为基于探针设计原则的随机序列；

13、所述外延探针序列与所有的目标mirna的基因序列不同。

14、优选地，所述3’端靶标序列筛选自所述目标mirna的3’端12-15个核苷酸，并且，将所筛选出的核苷酸片段中的u替换为t。

15、优选地，所述外延正向引物为来源于所述外延长引物中人工设计的所述5’端延伸序列；

16、所述外延探针为来源于所述外延长引物中人工设计的所述外延探针序列；

17、所述通用反向引物来源于所述茎环引物的序列。

18、此外，为解决上述问题，本发明还提供一种多重检测方法，包括：

19、s1，采集样本并提取样本mirna；

20、s2，配制反转录反应体系，并且在所述反转录反应体系中对所述样本mirna进行反转录反应，得到反转录反应液；

21、s3，利用如上述所述茎环引物，采用如上述所述的反转录引物设计方法设计每个目标mirna对应的mirna反转录引物；

22、s4，基于所述设计出的所述mirna反转录引物，配制多重pcr反应体系，并在所述多重pcr反应体系中，加入所有所述目标mirna对应的mirna反转录引物中的外延长引物、外延探针、外延正向引物和通用反向引物进行多重pcr反应；

23、s5，反应结束后，得到多重pcr检测结果。

24、本发明提供一种茎环引物，应用于多重检测技术领域，所述茎环引物的核苷酸序列如seq id no.1所示。

25、本发明中，根据所提供的茎环引物序列可以设计多种待检测的目标mirna的茎环反转录引物，实现了多种mirna在一管反应体系内的多重反转录，且同种茎环序列避免了不同茎环反转录效率的差异。

26、检测体系中设计的特异性外延长引物和外延探针序列实现了一管pcr反应体系内多种mirna的多重(根据荧光定量pcr仪器的检测通道数而定)检测。

27、靶标mirna和内参在同一管中逆转录和检测，极大降低了靶标mirna和内参在两个或多个反应体系中逆转录和检测产生的误差。

28、本发明的多重反转录和多重pcr检测方法既具有单重检测的灵敏度和特异性，也降低了mirna检测时间成本和试剂耗材成本。

29、本发明检测方法中的外延正向引物和外延探针序列是人工设计的特异性序列，可以在不同的核酸(dna和rna)检测体系中重复使用，节省了昂贵的新探针合成费用，实现了经济便捷性。