一种重组核酸酶及其应用

本发明涉及核酸酶，尤其涉及一种重组核酸酶及其应用。

背景技术：

1、目前，在市场上广泛使用的非特异性核酸酶是merck公司的它是一种来源于粘质沙雷氏菌serratia marcescen的基因工程改造的酶。它可以降解所有形式的dna和rna，包括单链、双链、线状、环状、天然以及变性的核酸，将它们消化成3-8个碱基长度的5-单磷酸寡核苷酸，且不具有碱基识别特异性，其最佳活性温度为37℃，广泛用于作为各类科学研究以及疫苗、蛋白、多糖类制药工业的酶制剂，去除样本或制品中的核酸残留，提升样本纯度和制品生物功效。该酶70℃加热10分钟或者65℃加热20分钟可使其失活，金属离子螯合剂可以抑制其活性。德国c-lecta gmbh公司的在另外的芽孢杆菌中产生，而美国ribosolutions公司的cyanasetm核酸酶衍生自另外一种微生物，它们都与性能相近。主要缺点是包括不能通过高温有效失活、低温条件下酶活性很低以及对反应体系中增加的盐离子浓度耐受度极为有限。为了弥补benzonase的上述缺点，市场上开发出了三款衍生自嗜冷微生物和嗜盐微生物的非特异性核酸酶，希望可以在低于37℃甚至在冷藏条件下(4℃-8℃)，在较宽的盐浓度和较宽的ph范围下维持较好的酶活性，且在一定温度下发生不可逆的酶失活，增加其安全性。这三款产品分别是日本宝生物(takara)公司的cryonasetm、挪威aecticzymes公司的hl-san以及波兰布里特有限公司的ppr核酸酶。它们的问题在于在某些条件下对高盐、低温以及低ph耐受较差或者酶活性维持对mg2+浓度要求较高导致对金属螯合剂过于敏感。

2、宿主dna残留污染在工业生产重组蛋白类或细胞与基因治疗(cgt)药物以及用于诊断、治疗及科学研究的酶的过程中是一个非常重要和亟需解决的问题。例如在基于核酸的诊断中，如果要保持良好的灵敏度和特异性以及无假阳性结果，对于体系中外源dna的含量要求极高。作为医药用途的治疗性蛋白、疫苗等产品生产工艺中对宿主dna残留的要求极为严格，根据产品使用量的不同，一般控制在10pg-10ng/剂的范围，而且这些药品通常对温度及其敏感，为了最大程度保持样品的生物学活性，样品处理的工艺过程通常在25℃甚至在4℃低温条件下进行。用于基因和细胞疗法的病毒载体也需要有效去除病毒包装过程中质粒dna和宿主细胞dna的残留。且这些值由世界卫生组织(who)、美国食品药品管理局(fda),欧洲药品管理局(emea)以及中国药品监督管理局(nmpa)等监管机构严格规定和监管。

3、用于去除核酸污染的理想工具是非特异性核酸酶，且其应满足在低温(4℃-25℃)、宽ph范围(5.5-10.0)以及常用纯化工艺(下游提纯处理)的高盐和/或含有添加剂条件下保持高活性。且该核酸酶应可以在对被纯化的生物制品安全的温度条件下失活。

4、国际专利wo2006095769描述了一种来自西瓦氏菌(psychrophilic strain ofshewanellasp.)的具有内切核酸酶活性的多肽，西瓦氏菌是嗜冷微生物，在低温下展现出较高的酶活性。利用它可去除蛋白溶液中存在的核酸并降低蛋白质提取物的黏度。但是它失活需要70℃孵育30分钟(doi:10.3389/fbioe.2015.00148)，这对核酸酶处理后的生物样品去除核酸酶活性非常不利，因为很多生物样品在70℃孵育30分钟均已失活。

5、国际专利wo2013/121228提出了一种来自于杀鲑别弧菌(aliivibriosalmonicida)的非特异性内切核酸酶及其活性片段，并命名为hl-san。其在低温条件下(25℃及以下)除了ph＝8.5左右外，酶活性均较差。

6、国际专利wo2021/049960描述了一种来自深海发光杆菌(photobacteriumprofundum)的非特异性内切核酸酶，并命名为ppr。其最适酶活性需要50-150mm mgcl2存在，尤其是在6℃冷藏条件下，需要500mm nacl和100mm mgcl2存在才能保持最佳酶活性。如此高的mg2+浓度证明该酶对金属螯合剂非常敏感，且增加了的mgcl2给下游纯化和目标蛋白质生物学活性带来了一定的不确定性。

7、正因为上述核酸酶仍存在各种不足，因此有必要开发宽温度、宽ph范围、宽离子浓度耐受的、热不稳定且高效低成本的内切核酸酶。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种重组核酸酶及其应用，其是一种在宽温度、宽ph范围、宽离子浓度下高活性的非特异性热不稳定且高效低成本的内切核酸酶。

2、本发明涉及一种核酸酶的定向筛选方法，包括通过生物信息学和卷积神经网络来获得定向优化的杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶变体。该定向筛选方法以已有的核酸酶序列一级结构分子描述符作为训练集，构建卷积神经网络模型；构建与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶具有至少50％同一性的随机序列库，并输入上述卷积神经网络模型以预测活性序列。

3、本发明一实施方式中，该定向筛选方法包括：1)筛选与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶同一性大于60％的序列，进行交叉比对并对氨基酸残基进行结构叠合聚类分析；2)根据序列同一性和氨基酸残基结构匹配的结果，将序列分为骨架区和可变区，然后将可变区的序列拆分为包含单氨基酸、双氨基酸、三氨基酸、四氨基酸、五氨基酸等五类短序列；3)通过随机序列生长和组合的方式，在骨架区基础上组合装配可变区的短序列，建立一个包含随机序列的潜在序列库，并与杀鲑别弧菌来源的非特异性内切核酸酶(wp_044583181.1)序列具有满足一定的同一性(50％<同一性<85％)；4)计算已有核酸酶序列((https://www.rcsb.org/3d-sequence/2pu3？assemblyid＝1))一级结构分子描述符并做归一化处理后作为训练集，对包含输入层、隐藏层和输出层的卷积神经网络进行预训练，隐藏层包含4个卷积层和2个池化层，输出层为密集连接层；5)对步骤3)得到的潜在序列库中的序列计算一级结构分子描述符并做归一化处理，使用步骤4训练好的模型进行预测，根据预测值选出最可能具核酸酶活力的前5条序列，如表2中所示，seq id no:1、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10。并对这5条序列进行溶解性预测，以及表达水平和酶活性检测。

4、本发明第一方面，提供一种重组核酸酶，其氨基酸序列为seq id no:1、seq idno:9、seq id no:10中的任一种所示；或与seq id no:1、seq id no:9、seq id no:10中的任一种所示的氨基酸序列具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％，或至少99.9％同一性的序列。

5、本发明一实施方式中，所述重组核酸酶为非特异性核酸内切酶。所述重组核酸酶对核酸的序列没有严格要求，可以非特异性地降解几乎所有形式的核酸。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶的底物包括单链，双链，线性和环状dna和rna、rna-dna杂交体、以及基因组dna中的任一种或几种。该底物还可以为包含脱氧次黄苷、脱氧尿苷或羟甲基脱氧尿苷等碱基衍生物的核酸。

6、本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在广泛条件范围具有很高的核酸降解活性，能将核酸完全消化成杂交限度以下的2-5个碱基长度的寡核苷酸。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在温度(4～50℃)或者ph值(5.0～10.0)范围内具有核酸降解活性。比如，本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在低温(4℃)时，仍具有较好的活性。比如，本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在ph(5.5～10.0)时，具有很好的活性。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在低ph(5.5)时，具有较好的酶解活性。

7、本发明一实施方式中，所述重组核酸酶可耐受一定浓度的盐离子(0～1.5m)。所述重组核酸酶在盐离子浓度0～1.5m范围内具有核酸降解活性。本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在盐离子(0～1.0m)时，具有很好的酶解活性。所述重组核酸酶在高盐(1.0m)时，仍具有很好的酶解活性。

8、本发明一实施方式中，所述重组核酸酶在mg2+浓度0-80mm范围内具有核酸降解活性，所述重组核酸酶在mg2+浓度5-60mm范围内，具有很好的核酸降解活性，所述重组核酸酶不必在mg2+(0mm)激活下，仍能具有很好的酶解活性。

9、本发明一实施方式中，所述重组核酸酶可耐受一定浓度的抑制剂，所述抑制剂包括但不限于nacl(0.25～1.5m)、尿素(0～8m)、盐酸胍(0～6m)、硫酸铵(0～0.2m)、咪唑(0～0.5m)。

10、本发明一实施方式中，所述重组核酸酶适用于多种培养基或缓冲液。所述培养基或缓冲液包括rpmi1640、mem、dmem、cd-cho、pbs、tbs、tris-hcl、nacl、mgcl2。本发明的重组核酸酶在多种培养基或缓冲液中均具有酶活性。比如在rpmi1640培养基、mem、dmem、cd-cho等培养基均具有酶活性。又比如在pbs缓冲液、tbs缓冲液、tris-hcl缓冲液中均具有酶活性。

11、本发明一实施方式中，相较于耐高盐hl-san核酸酶，所述重组核酸酶可耐受更低浓度的盐离子，在250mm和500mm有显著活性，且耐更宽的ph(5.5-10)范围和温度范围(4～50℃)。

12、本发明一实施方式中，所述重组核酸酶还包括标签、信号肽、前导肽和/或核定位序列。优选地，所述标签包括his-或hq-标签。本发明一实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列为mkyllptaaagllllaaqpama(seq id no.2)。

13、本发明第二方面，提供编码上述重组核酸酶的多核苷酸。

14、本发明一实施方式中，所述多核苷酸的序列如seq id no:4所示，或与seq id no:4所示序列具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％，或至少99.9％序列同一性的序列。

15、本发明第三方面，提供含有上述多核苷酸或表达上述重组核酸酶的生物材料。

16、本发明一实施方式中，所述生物材料包括核酸构建体、表达载体、宿主细胞。

17、本发明一实施方式中，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列，所述多核苷酸在一个或多个控制序列作用下在宿主细胞中的表达。

18、本发明一实施方式中，所述控制序列包括但不限于启动子、终止子。

19、本发明一实施方式中，所述启动子包括但不限于lac、tac、trp、trc、cmv、ef1α、h1、t7、sv40、pmc1、pgk。优选地，所述启动子为t7启动子。

20、本发明一实施方式中，所述终止子包括但不限于t0、t7、rrnb、sv40、hgh、bgh、rbglob。优选地，所述终止子为t7终止子。

21、本发明一实施方式中，所述表达载体包括所述多核苷酸或核酸构建体。本发明一实施方式中，所述表达载体可由所述多核苷酸和控制序列连接在一起获得。本发明一实施方式中，所述表达载体可包括一个或多个限制位点以允许所述多核苷酸在此类位点处的插入或取代。本发明一实施方式中，所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入所述表达载体中而表达所述核酸酶。

22、本发明一实施方式中，所述表达载体可以是经dna重组程序并且可以引起所述核苷酸表达的任何载体，例如，质粒或病毒。本发明一实施方式中，所述质粒或病毒包括但不限于质粒pbr322、puc19、pacyc177、pet32a、pacyc184、pub110、pe194、pta1060、pamβ1、aav、腺病毒载体、慢病毒载体等。

23、本发明一实施方式中，所述表达载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。所述选择性标记提供了包括抗生素抗性基因、重金属抗性基因、营养标记基因、生化标记基因等。比如氨苄青霉素抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kanr)、四环素抗性基因(tetr)、链霉素抗性基因(strr)、氯霉素抗性基因(cmlr)、g418抗性基因(g418r)、铜抗性基因(cur)、锌抗性基因(znr)、镉抗性基因(cdr)、色氨酸合成酶基因(trp1)、尿嘧啶合成酶基因(ura3)、亮氨酸合成酶基因(leu2)、组氨酸合成酶基因(his4)、β-半乳苷酶基因(lacz)、葡萄糖苷酸酶基因(gus)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,gs)、二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase,dhfr)等。

24、本发明一实施方式中，所述宿主细胞包括但不限于细菌、真菌、病毒、哺乳动物细胞或植物细胞。

25、本发明第四方面，提供含有上述重组核酸酶、多核苷酸和/或生物材料的组合物。

26、本发明一实施方式中，所述组合物还可以含有以下任一种或几种其他酶，包括dna聚合酶、蛋白酶、磷酸酶、t4 pnk、rna酶h、脱氧核苷酸激酶。

27、本发明一实施方式中，所述组合物还可以包括缓冲液、镁离子、鸟嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、atp、钠离子、表面活性剂中的一种或几种。所述缓冲液包括tris-hcl缓冲液、pbs(磷酸盐缓冲液)、te缓冲液等。

28、本发明第五方面，提供包括上述核酸酶、多核苷酸、生物材料、组合物的试剂盒。

29、本发明第六方面，提供上述核酸酶、多核苷酸、生物材料、组合物、试剂盒在制备以下任一种用途试剂中的应用，1)药物纯化，优选所述药物包括病毒载体、重组蛋白；2)提升基因分析灵敏度，优选所述基因分析包括pcr、qpcr、3sr、sda、ngs、lar/lcr和lamp；3)降低蛋白裂解液粘度，优选所述蛋白裂解液包括细胞、组织、微生物的蛋白裂解液；4)裂解或降解核酸，所述核酸包括dna或rna。

30、本发明第七方面，提供一种生产上述重组核酸酶的方法，该方法包括培养上述宿主细胞，及从培养物收集所述重组核酸酶。

31、本发明第八方面，提供一种裂解或降解核酸的方法，包括在核酸中加入所述重组核酸酶、多核苷酸、组合物、生物材料或试剂盒。

32、本发明一实施方式中，所述核酸包括单链，双链，线性和环状dna和rna、rna-dna杂交体、以及基因组dna。

33、本发明第九方面，提供一种从样品中去除核酸的方法，包括在样品中加入所述核酸酶、多核苷酸、组合物、生物材料或试剂盒。

34、本发明一实施方式中，所述样品是生物大分子样品。所述样品包含核酸、蛋白质、病毒载体、碳水化合物、聚合物或脂质。本发明一实施方式中，所述样品包含双链核酸、目的dna:rna双链体或重组产生的蛋白质，特别是酶、疫苗、疫苗接种抗原、抗体以及其他治疗性蛋白质。本发明一实施方式中，所述样品是核酸扩增反应或逆转录反应的反应物。本发明一实施方式中，所述核酸扩增反应选自pcr、qpcr、3sr、sda、ngs、lar/lcr和lamp。本发明一实施方式中，所述样品包括用于蛋白分析的样品，所述蛋白分析包括elisa、柱层析、二维电泳和印迹分析。本发明一实施方式中，所述样品包括car-t细胞治疗中慢病毒载体(lv)、基因治疗中腺病毒载体(adv)和腺相关病毒载体(aav))。

35、本发明第十方面，提供一种降低蛋白裂解液粘度的方法，所述方法包括在所述蛋白裂解液中加入所述核酸酶、多核苷酸、组合物、生物材料或试剂盒。所述蛋白裂解液包括细胞、组织和/或微生物的蛋白裂解液。

36、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

37、本发明的热不稳定的重组核酸酶，在大分子药物(如疫苗、抗体、病毒颗粒等)纯化过程中或者其他如pcr、细胞与干细胞治疗等过程中所使用的缓冲液处于盐离子和/或添加剂存在条件下，在较宽温度范围(4-40℃)，较宽ph范围(5.5-10)和较宽nacl离子浓度(250mm-1000mm)条件下，仍保有良好的非特异性核酸切割活性，可显著降低在上述溶液中核酸的含量并降低由大量核酸所致的溶液粘度增加。

38、该核酸酶可用于基因和细胞治疗用病毒载体(包括car-t细胞治疗中慢病毒载体(lv)、基因治疗中腺病毒载体(adv)和腺相关病毒载体(aav))的纯化工艺中；还可用于纯化重组蛋白，特别是各种酶、疫苗、疫苗接种抗原、抗体以及其他治疗性蛋白质纯化工艺中；此外，还可用于净化pcr、qpcr、3sr、sda、ngs、lar/lcr和lamp反应性试剂以及混合物中用于降低干扰核酸(包括dna和rna)，提升相关基因分析的灵敏度和特异性的用途。或用于降低细胞、组织、微生物等蛋白裂解液样品的粘度等(可以用于化学破菌而省去超声仪或高压均质机，或者结合化学破菌大幅度减少超声仪或高压均质机的工作负荷)。