组合物、提高CD39-CD69-T细胞比例的方法与流程

本发明涉及细胞培养，特别涉及组合物、提高cd39-cd69-t细胞比例的方法。

背景技术：

1、过继性t细胞疗法（adoptive t cell therapy，act）是指通过回输体外扩增培养的免疫t细胞，以提高机体抗肿瘤免疫功能的肿瘤治疗方法。这些过继细胞包括嵌合抗原受体（car）t细胞、t细胞受体（tcr）t细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（til）等。t细胞的培养方式不仅决定了细胞扩增的倍数还会影响细胞的表型。回输至患者体内的t细胞数量和细胞表型都会影响抗肿瘤效果。2020年发表于science的一篇研究表明，黑色素瘤患者回输的免疫细胞中cd8+cd39-cd69-细胞数量与无进展生存期和黑色素瘤特异性生存期的改善显著相关，且呈剂量依赖性。进一步的动物实验证实了cd39-cd69-t细胞具有更强的抗肿瘤能力。因此，如何体外扩增获得高比例cd39-cd69-t细胞可能是提高过继性t细胞疗法疗效的突破口。

2、传统的t细胞培养方法主要通过cd3单抗和/或cd28单抗活化t细胞，再利用il-2大量扩增t细胞，获得的cd39-cd69-t细胞比例很小（<15%）。为了获得高比例cd39-cd69-t细胞可以采用crispr/cas、talen和zfn等基因编辑方法敲除cd39及cd69基因，但是该方法操作复杂，且存在脱靶风险，所获得的t细胞具有较大的安全性风险。此外，还可以通过磁珠分选及流式分选等方法富集cd39-cd69-t细胞，该方法操作复杂、成本高，且获得的cd39-cd69-的t细胞数量较少。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了组合物、提高cd39-cd69-t细胞比例的方法。本发明提供了一种简单方便又能获得大量cd39-cd69-t细胞的培养方法，为细胞治疗持久的抗肿瘤作用提供了更好的可能。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了组合物在如下任意项中的应用：

4、（i）、t细胞培养；和/或

5、（ii）、提高cd39-cd69-t细胞比例；

6、所述组合物包括il21、il15和cd137l。

7、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括ifn-γ、cd3单抗和cd28单抗。

8、本发明还提供了组合物，包括：100~2000 ng/ml cd3单抗、100~2000 ng/ml cd28单抗、200~2000 iu/ml il2、100~2000 ng/ml il15、100~2000 ng/ml il21和cd137l固化蛋白。

9、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物包括：500 ng/ml cd3单抗、500 ng/ml cd28单抗、1000 iu/ml il2、500~2000 ng/ml il15、500~2000 ng/ml il21和500~2000ng/ml cd137l固化蛋白。

10、在本发明的一些具体实施方案中，所述cd137l固化蛋白由cd137l蛋白固化至载体表面获得，所述载体包括细胞培养瓶、细胞培养板、微球或滋养层细胞。

11、在本发明的一些具体实施方案中，所述cd137l固化蛋白的浓度包括100~2000 ng/ml；优选地，所述cd137l固化蛋白的浓度包括500~2000 ng/ml。

12、本发明还提供了所述组合物在如下任意项中的应用：

13、（i）、t细胞培养；和/或

14、（ii）、提高cd39-cd69-t细胞比例。

15、本发明还提供了t细胞培养的方法和/或提高cd39-cd69-t细胞比例的方法，采用所述组合物培养单个核细胞，获得目标细胞。

16、在本发明的一些具体实施方案中，所述方法包括如下步骤：

17、步骤1、取单个核细胞，于a0培养基中培养；所述a0培养基包括5%~10%（v/v）的血浆和/或血清、2000 iu/ml ifn-γ；

18、步骤2、于a1培养基中培养；所述a1培养基包括5%~10%（v/v）血浆和/或血清、500ng/ml cd3单抗、500 ng/ml cd28单抗和1000 iu/ml il2；

19、步骤3、于a2培养基中活化培养；所述a2培养基包括5%~10%（v/v）血浆和/或血清、100~2000 ng/ml il15和100~2000 ng/ml il21；

20、所述活化培养包括采用包含cd137l固化蛋白的载体培养；

21、步骤4、于扩增培养基中培养获得目标细胞；所述扩增培养基包括1000 iu/mlil2。

22、在本发明的一些具体实施方案中，所述单个核细胞的来源包括外周血和/或脐血；或

23、所述培养基包括免疫细胞培养基；或

24、所述血清和/或血浆包括自体血浆、脐血浆、ab血清、胎牛血清或血清替代物中的一种或多种；或

25、所述包含cd137l固化蛋白的载体的制备方法包括：取含有100~2000 ng/mlcd137l-fc的蛋白包被液于培养瓶中，4~37℃下孵育1~24h获得所述包含cd137l固化蛋白的载体。

26、在本发明的一些具体实施方案中，所述a2培养基包括5%~10%（v/v）血浆和/或血清、1000 iu/ml il2以及500~2000 ng/ml il15和500~2000 ng/ml il21；

27、所述包含cd137l固化蛋白的载体的制备方法包括：取含有500~2000 ng/mlcd137l-fc的蛋白包被液，按照50~300μl/cm2的使用量置于培养瓶中，4~37℃下孵育1~24h获得所述包含cd137l固化蛋白的载体。

28、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述培养的时间包括1天；或

29、步骤2所述培养的时间包括3天；或

30、步骤3所述培养的时间包括3天；或

31、步骤4所述扩增培养基培养的时间包括7~21天。

32、所述包含cd137l固化蛋白的载体的制备方法中，所述孵育的条件包括4℃放置过夜、常温放置2~3小时或37℃放置1小时。

33、本发明还提供了经所述培养方法获得的细胞。

34、本发明还提供了所述细胞在制备抗肿瘤的药物和/或药物组合中的应用。

35、本发明还提供了药物和/或药物组合，包括所述细胞。

36、本发明还提供了预防和/或治疗肿瘤的方法，向受试者施用如下任意项：

37、（i）、所述细胞；

38、（ii）、所述药物和/或药物组合。

39、本发明包括但不限于提供了如下有益效果：

40、本发明提供了一种简单方便又能获得大量cd39-cd69-t细胞的培养方法。本发明所述培养方法，不需要经过基因编辑或细胞筛选，无基因脱靶风险，可以在不纯化的前提下，大幅提升t细胞的扩增水平并提升cd39-cd69- t细胞比例至50%以上，抗肿瘤能力也大幅提升。