一种氨基多糖辐射与酶解耦合制备氨基寡糖的方法及应用与流程

本发明涉及氨基寡糖制备，尤其涉及一种氨基多糖辐射与酶解耦合制备氨基寡糖的方法及应用。

背景技术：

1、壳聚糖是由甲壳素部分脱乙酰基形成的一种氨基多糖，由于其分子量较大，难以溶于水、碱和一般有机溶剂中，不易被机体吸收，导致其应用受限。壳寡糖是由壳聚糖降解获得的聚合度为2～20的氨基寡糖，其具有较好的水溶性，在机体内易于被吸收，因而在医药、食品、化妆品等领域具有很大的研究意义和应用价值。

2、壳寡糖的分子量会对其性质和功能产生很大的影响，其一些性质和功能只有特定的聚合度下才能表现出来。例如，有研究(张小倩.基于多组学研究单一聚合度壳寡糖对小麦的代谢调控机制[d].中国科学院大学(中国科学院海洋研究所),2018.)对小麦幼苗喷施不同聚合度的壳寡糖，发现聚合度大于3是壳寡糖发挥促生长活性的必要条件，且聚合度为5～10的壳寡糖促进小麦幼苗生长以及增强其叶片光合作用的效果优于其他聚合度的壳寡糖。

3、壳聚糖酶存在于很多细菌和真菌中，是一种能够将壳聚糖降解成壳寡糖的专一性酶，不同来源的壳聚糖酶降解壳聚糖的产物存在差异。目前，已报道过的壳聚糖酶降解壳聚糖产生的壳寡糖聚合度大多低于5(如专利cn113249260b中的水丛毛单胞菌sh-50所产生的壳聚糖酶降解壳聚糖的产物聚合度为2～4，专利cn113278546b中的枯草芽孢杆菌lc1-1所产生的壳聚糖酶降解壳聚糖的产物是单糖、壳三糖和壳四糖)，鲜有降解产物在5～10之间的壳聚糖酶。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了株可用于降解壳聚糖制备壳寡糖的陶厄氏菌。该陶厄氏菌xhzg02能够产生壳聚糖酶，利用其发酵液可有效降解壳聚糖，并获得聚合度为5～8的壳寡糖，为壳聚糖酶的制取以及壳聚糖的降解提供了新的菌种资源。

2、本发明还提供了一种壳聚糖辐射与酶解耦合制备壳寡糖的方法。该方法在采用陶厄氏菌xhzg02的发酵液进行酶解前，对壳聚糖进行了等离子体辐射处理，能够提高酶解效率，使发酵液无需分离纯化出壳聚糖酶，即可实现较好的壳聚糖降解效果。

3、本发明的具体技术方案为：

4、第一方面，本发明提供了一株可用于降解壳聚糖制备壳寡糖的陶厄氏菌，所述陶厄氏菌命名为xhzg02，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27723，微生物分类命名为thauera humireducens，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

5、thauera humireducens是陶厄氏菌属中的一个种(目前暂无统一的中文译名)，已报道过该种内存在能够降解苯胺的菌株，以及能够合成钯纳米颗粒的菌株等，尚未报道过其中有菌株能够产生壳聚糖酶。本发明首次在该种内发现了一个能够产生壳聚糖酶的菌株xhzg02(分离自土壤)，利用其发酵液，不仅能够有效降解壳聚糖，且获得的壳寡糖聚合度为5～8，为壳聚糖酶的制取以及壳聚糖的降解提供了新的菌种资源，并能满足聚合度为5～8的壳寡糖的应用需求。

6、第二方面，本发明提供了一种由上述陶厄氏菌制得的发酵液。

7、第三方面，本发明提供了上述陶厄氏菌或上述发酵液在降解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

8、第四方面，本发明提供了一种壳聚糖辐射与酶解耦合制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：

9、(1)采用上述陶厄氏菌进行发酵，获得发酵液；

10、(2)将壳聚糖分散到分散介质中后，进行等离子体辐射，获得初步降解壳聚糖溶液；

11、(3)将发酵液加入到初步降解壳聚糖溶液中，进行酶解，获得壳寡糖。

12、利用等离子体产生的高能活性粒子初步降解壳聚糖，能够提高壳聚糖的溶解性，降低壳聚糖溶液粘度，有利于后续酶解过程中壳聚糖与壳聚糖酶相互接触，提高酶解效率。配合等离子体辐射处理，陶厄氏菌xhzg02的发酵液无需分离纯化出壳聚糖酶，直接用于酶解即可实现较好的壳聚糖降解效果，获得聚合度为5～9的壳寡糖。

13、作为优选，步骤(1)的具体过程包括以下步骤：将所述陶厄氏菌活化后，按照3～4％的接种量接种到发酵培养基中，在30～33℃下发酵2～3d，期间分批补充发酵培养基；发酵完成后，去除菌体，获得发酵液；所述发酵培养基的ph为6.8～7.5，包括以下浓度的组分：壳聚糖3～5g/l，蛋白胨8～12g/l，酵母提取物4～6g/l，氯化钠8～12g/l。

14、进一步地，所述分批补充发酵培养基的方法如下：在发酵开始后20～25h，补充一次发酵培养基，而后每隔7～12h补充一次发酵培养基，每次补充的发酵培养基体积为初始发酵培养基体积的20～30％。

15、作为优选，步骤(2)中，所述分散介质是浓度为0.5～1.0wt％的乙酸水溶液，所述壳聚糖与分散介质的质量体积比为9～15g：100ml。

16、作为优选，步骤(2)中，所述等离子体辐射的过程中，功率为100～120w，照射距离为2～4mm，等离子体温度为20～30℃，时间为30～40min。

17、作为优选，步骤(3)中，所述发酵液与初步降解壳聚糖溶液的体积比为3～6：10。

18、作为优选，步骤(3)中，在酶解前，调节ph至5.0～6.0；所述酶解的温度为45～50℃，时间为0.5～1h。

19、第五方面，本发明提供了壳寡糖在植物生长促进剂中的应用，所述壳寡糖采用上述方法制得。

20、作为优选，所述植物生长促进剂用于增强小麦的光合作用。

21、已有研究表明，相较于聚合度小于5或大于10的壳寡糖而言，聚合度为5～10的壳寡糖能在更大程度上提高小麦中的叶绿素含量，增强其光合作用。因此，本发明中制得的壳寡糖能够较好地增强小麦光合作用。

22、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

23、(1)本发明提供的陶厄氏菌xhzg02能够产生壳聚糖酶，利用其发酵液能够有效降解壳聚糖，而目前尚未报道过其所属的种(thauera humireducens)内存在能够产生壳聚糖酶的菌株；并且，该菌株降解壳聚糖的产物是聚合度为5～8的壳寡糖，能够满足该聚合度范围内的壳寡糖的应用需求。

24、(2)本发明将等离子体辐射与酶解耦合，能够提高酶解效率，使陶厄氏菌xhzg02的发酵液无需分离纯化出壳聚糖酶，即可实现较好的壳聚糖降解效果。

技术特征：

1.一株可用于降解壳聚糖制备壳寡糖的陶厄氏菌，其特征在于，所述陶厄氏菌命名为xhzg02，已在2023年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27723，微生物分类命名为thauera humireducens。

2.一种由如权利要求1所述陶厄氏菌制得的发酵液。

3.如权利要求1所述陶厄氏菌或如权利要求2所述发酵液在降解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

4.一种壳聚糖辐射与酶解耦合制备壳寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程包括以下步骤：将所述陶厄氏菌活化后，按照3~4%的接种量接种到发酵培养基中，在30~33℃下发酵2~3d，期间分批补充发酵培养基；发酵完成后，去除菌体，获得发酵液；所述发酵培养基的ph为6.8~7.5，包括以下浓度的组分：壳聚糖3~5g/l，蛋白胨8~12g/l，酵母提取物4~6g/l，氯化钠8~12g/l。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分散介质是浓度为0.5~1.0wt%的乙酸水溶液，所述壳聚糖与分散介质的质量体积比为9~15g：100ml。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述等离子体辐射的过程中，功率为100~120w，照射距离为2~4mm，等离子体温度为20~30℃，时间为30~40min。

8.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵液与初步降解壳聚糖溶液的体积比为3~6：10。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，在酶解前，调节ph至5.0~6.0；所述酶解的温度为45~50℃，时间为0.5~1h。

10.壳寡糖在植物生长促进剂中的应用，其特征在于，所述壳寡糖采用如权利要求4~9之一所述方法制得。

技术总结本发明涉及氨基寡糖制备技术领域，公开了一种氨基多糖辐射与酶解耦合制备氨基寡糖的方法及应用。本发明利用陶厄氏菌xhzg02的发酵液，能够将壳聚糖降解成聚合度为5~8的壳寡糖，为壳聚糖酶的制取以及壳聚糖的降解提供了新的菌种资源，并能满足聚合度为5~8的壳寡糖的应用需求；此外，本发明在采用陶厄氏菌xhzg02的发酵液进行酶解前，对壳聚糖进行了等离子体辐射处理，能够提高酶解效率，使发酵液无需分离纯化出壳聚糖酶，即可实现较好的壳聚糖降解效果。技术研发人员：郑刚,闻正顺,姚燕来,刘妍,石爱琴,贾保磊,蒲中机受保护的技术使用者：湘湖实验室（农业浙江省实验室）技术研发日：技术公布日：2024/6/18