一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法及其应用与流程

本发明涉及基因测序和组织细胞样本分析，特别涉及一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法及其应用。

背景技术：

1、众所周知复杂的生命机体由许多性质特异的细胞组成，在特定组织的特定位置每个细胞表达的核酸的种类与数量都有所不同，所以在单细胞水平上能够同时检测单细胞所在组织空间位置和单细胞rna表达水平的分析技术具有重大科研意义和商业价值。

2、目前，可以在不同空间分辨率上实现真正的单细胞转录组和空间位置联合分析，这类技术的共同点是首先对组织切片的细胞核进行空间位置标记，然后再通过解离或者抽核制备偶联有位置标记的单细胞核悬液。由于不同组织中细胞的分布和密度不同，来源于不同组织的单张10-30μm厚度的切片通常可以制备到2-30万个单细胞核，而且单细胞核悬液中往往具有大量组织碎片，由此带来了两个问题：1.为了尽可能的得到更精细的组织空间结构，我们需要将制备得到的所有细胞核用于单细胞分析，然而现有的高通量单细胞处理通量是每次反应只能分析1~2万细胞，那么需要对应15次以上的单细胞建库试剂耗材才能处理30万细胞，这极大的增加了建库试剂和人力运营成本； 2.这些来源于组织的大量碎片无法通过常规的密度梯度离心去除，但在切片处理过程中也和细胞核一样会结合空间位置标签，如果来源于不同位置的碎片和细胞核被同一个细胞标签标记，例如被包裹进同一个液滴内被同一个水凝胶标签微珠标记，那么会影响真正细胞核的位置判定，因此，亟需一种更准确识别空间位置信息的建库方法。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提出一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法及其应用，旨在在单细胞水平上以超高通量（≥10万细胞）分析遗传信息的同时还可以解决组织的大量碎片的干扰，从而能够精准判断细胞空间位置。

2、为实现上述目的，本发明提出一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，包括以下步骤：

3、s10、提供具有位置标签序列的空间芯片；

4、s20、将待测的组织切片与所述具有位置标签序列的空间芯片结合，以使得所述位置标签序列结合到所述待分析的组织切片的细胞核中，回收含有位置标签序列的细胞核；

5、s30、提供多重逆转录标签引物，将所述多重逆转录标签引物与所述细胞核混合进行逆转录反应、细胞标记，得到包含细胞标签的液滴；

6、s40、将所述包含细胞标签的液滴破乳并解交联，进行空间标签文库构建和转录组文库构建并测序，得到待测组织切片中单细胞的位置信息及对应的单细胞转录组序列信息。

7、在一实施方式中，步骤s20中，所述待测的组织切片的获取步骤包括：将组织切片固定、透化，得待测的组织切片。

8、在一实施方式中，所述固定采用的固定液包括醛类固定液、酸类固定液、醇类固定液、dsp交联剂中至少一种；和/或，

9、在一实施方式中，所述透化采用的表面活性剂包括醇类表面活性剂。

10、步骤s30包括：

11、s301、提供多重逆转录标签引物，其中，所述多重逆转录标签引物包括固定序列、多重标签序列和引物序列，将所述多重逆转录标签引物与所述细胞核混合进行逆转录反应，得到带有不同多重标签序列的细胞核；

12、s302、提供微珠，所述微珠具有液滴标签，将所述带有不同多重标签序列的细胞核与所述微珠混合，进行连接反应，用以连接所述液滴标签，得包含细胞标签的液滴，其中，所述细胞标签包含多重标签序列和液滴标签。

13、在一实施方式中，所述引物序列包括随机引物或者多聚寡核苷酸；和/或，

14、所述固定序列包括任意碱基的组合，其中，所述固定序列的长度为2~20bp；和/或，

15、所述多重标签序列包含多种不同的序列，其中，各所述多重标签序列的长度为2~50bp。

16、在一实施方式中，步骤s301中，所述多重标签序列包含多种不同的序列，所述多种不同的序列包括s1~s16，其中，所述s1~s16的序列分别如seq id no.1所示、seq id no.2所示、seq id no.3所示、seq id no.4所示、seq id no.5所示、seq id no.6所示、seq idno.7所示、seq id no.8所示、seq id no.9所示、seq id no.10所示、seq id no.11所示、seq id no.12所示、seq id no.13所示、seq id no.14所示、seq id no.15所示和seq idno.16所示。

17、在一实施方式中，步骤s40包括以下步骤：

18、s401、将所述包含细胞标签的液滴破乳并解交联，得到带有细胞标签的核酸混合物；

19、s402、将所述核酸混合物依次进行模板转换、空间标签文库构建和转录组文库构建、高通量测序后分析，得到待测组织切片中单细胞的位置信息及对应的单细胞转录组序列信息。

20、本发明还提供一种测序方法，包括以下步骤：

21、采用如上述任意一项所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法构建的测序文库，对所述测序文库进行测序。

22、本发明还提供一种建库试剂盒，包括上述任意一项所述的高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法构建的测序文库。

23、本发明中，首先将待测组织切片与具有位置标签序列的空间芯片结合，释放含有位置信息的核酸分子以结合到邻近的组织切片中的细胞核上，回收细胞核，同时提供多重逆转录标签引物，所述多重逆转录标签引物可以延伸回收的细胞核内的位置标签序列和rna序列，从而使细胞核标记上多重标签序列，通过油包水连接反应获得包含细胞标签的液滴，即使获得的每个液滴内包裹数个细胞也可通过多重标签序列进行区分，而不用担心细胞之间的核酸相互污染，将获得的细胞标签的液滴破乳并解交联，进行空间标签文库构建和转录组文库构建并测序、分析后，就能通过细胞标签反向获得待测组织切片中细胞核对应的位置标签序列。

技术特征：

1.一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，步骤s10中，所述具有位置标签序列的空间芯片上每个位点都具有已知核酸碱基序列编码的位置信息，不同位点上具有不同碱基序列的核酸分子，同一位点上具有相同碱基序列的核酸分子。

3.如权利要求1所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，步骤s20中，所述待测的组织切片的获取步骤包括：将组织切片固定、透化，得待测的组织切片。

4.如权利要求3所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，

5.如权利要求1所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，步骤s30包括：

6.如权利要求5所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，

7.如权利要求5所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，步骤s301中，所述多重标签序列包含多种不同的序列，所述多种不同的序列包括s1~s16，其中，所述s1~s16的序列分别如seq id no.1所示、seq id no.2所示、seq id no.3所示、seq id no.4所示、seq id no.5所示、seq id no.6所示、seq id no.7所示、seq idno.8所示、seq id no.9所示、seq id no.10所示、seq id no.11所示、seq id no.12所示、seq id no.13所示、seq id no.14所示、seq id no.15所示和seq id no.16所示。

8.如权利要求1所述的一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法，其特征在于，步骤s40包括以下步骤：

9.一种测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.一种建库试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至8任意一项所述的高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法构建的测序文库。

技术总结本发明公开了一种高效的单细胞空间位置和遗传信息共分析的建库方法及其应用，包括步骤：S10、提供具有位置标签序列的空间芯片；S20、将待测的组织切片与具有位置标签序列的空间芯片结合，以使得位置标签序列结合到待分析的组织切片的细胞核中，回收含有位置标签序列的细胞核；S30、提供多重逆转录标签引物，将多重逆转录标签引物与所述细胞核混合进行逆转录、细胞标记，得包含细胞标签的液滴；S40、将包含细胞标签的液滴破乳并解交联，进行测序，得待测组织切片中单细胞的位置信息及对应的单细胞转录组信息。本方法以超高通量在单细胞水平上分析遗传信息，还能够有效去除来源于组织碎片的干扰，得到精准的单细胞空间位置信息。技术研发人员：桑国芹,石焕焕,李研,韩金桓,孙佳成,马兴勇,职小玲,智敏,关荧,张广鑫,焦少灼,李宗文受保护的技术使用者：北京寻因生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18