一种强化硫氧化功能的工程菌及其构建方法与应用

本发明属于生物，涉及一种强化硫氧化功能的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、含硫化合物广泛存在于制药、发酵等行业的发酵液、废气中，具有造成动植物中毒，腐蚀金属管路，形成酸雨等危害。目前脱硫方法有物理法、化学法以及微生物法。微生物脱硫法因其无二次污染、不需要化学催化剂等优点，已成为目前主要脱硫技术。嗜盐嗜碱硫氧化菌是目前主要的生物脱硫菌株，包括硫碱弧菌属（thioalkalivibrio）、硫微螺菌属（thiomicrospira）、硫碱杆菌属（thioalkalibacter）、硫碱微菌属（thioalkalimicrobium）等。其中，硫碱弧菌属硫氧化菌因具有生长速度快、易培养等优势，成为工业应用较多的生物脱硫菌株。但在生物脱硫过程中，仍存在硫碱弧菌的硫氧化速率较低、单质硫产率不高等问题，限制了其应用、推广。

2、经过对硫氧化菌硫代谢途径的分析，发现将硫化物氧化为聚硫化物的过程由两种酶完成，分别是细胞色素c硫化物脱氢酶fccab和硫醌氧化还原酶sqr。这两种酶将氧化过程产生的电子分别转移至细胞色素c和醌池，电子传递至细胞色素c消耗的能量要高于通过泛素传递至醌池的能量，因此，sqr比fcc氧化过程更节省能量。而通过生物信息学对比发现，硫碱弧菌属菌株基因组中往往仅存在fcc基因，不存在sqr基因。

3、硫化物氧化生成的聚硫化物或以单质硫的形式直接排出胞外，或进一步氧化为硫酸盐。聚硫化物氧化为硫酸盐会降低单质硫的产率，因此要竭力避免。研究发现，硫碱弧菌胞内存在两条将聚硫化物氧化为硫酸盐的路径，分别位于周质空间和细胞质。其中，位于细胞内膜上的跨膜蛋白yild负责将聚硫化物运输至细胞质，从而开启在细胞质内的氧化途径。而位于周质空间的硫氧化蛋白家族sox可以将聚硫化物氧化为硫酸盐，其中soxb是该家族中最关键的氧化酶。

4、因此，为了解决硫碱弧菌的硫氧化速率较低、单质硫产率不高的问题，亟需提供一种强化硫氧化功能的工程菌。在硫碱弧菌中异源表达硫醌氧化还原酶sqr，实现细胞色素c硫化物脱氢酶fccab和硫醌氧化还原酶sqr的共表达，提高硫氧化速率；同时，敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild和硫氧化酶soxb，降低聚硫化物继续氧化为硫酸根，提高单质硫产率。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种强化硫氧化功能的工程菌及其构建方法与应用，在硫碱弧菌中异源表达硫醌氧化还原酶sqr，实现细胞色素c硫化物脱氢酶fccab和硫醌氧化还原酶sqr的共表达，同时，敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild和硫氧化酶soxb，同步提高硫氧化速率和单质硫产率。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种强化硫氧化功能的硫碱弧菌工程菌的构建方法，所述构建方法包括：

4、在硫碱弧菌中异源表达硫醌氧化还原酶sqr，敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild和硫氧化酶soxb。

5、本发明的工程菌通过构建表达载体，表达外源硫醌氧化还原酶，提高硫化物的氧化速率。相比野生菌，异源表达硫醌氧化还原酶sqr工程菌在气升式反应器中硫化钠氧化速率提高15.4%。

6、优选地，所述在硫碱弧菌中异源表达硫醌氧化还原酶sqr包括：

7、分别培养含有重组质粒的大肠杆菌sm10感受态细胞和硫碱弧菌，所述重组质粒含有硫醌氧化还原酶基因sqr，od600均达到0.4-0.8时离心，离心后使用碱性碳酸氢钠培养基溶液洗涤菌体得到大肠杆菌菌液和硫碱弧菌菌液，混匀两种菌液后点到含酵母粉的碱性nacl固体培养基上，初次培养，用碱性nacl液体培养基溶液重悬初次培养得到的菌体后，取菌液涂布于碱性碳酸氢钠固体培养基上再次培养，即得所述强化硫氧化功能的硫碱弧菌工程菌。

8、上述0.4-0.8中的具体点值可以选择0.4、0.5、0.6、0.7、0.8等。

9、优选地，所述硫醌氧化还原酶基因的来源包括盐单胞菌、泥生绿硫菌、荚膜红细菌、脱氮副球菌、酒色着色菌、嗜盐隐杆藻、氧化亚铁硫杆菌、假单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热古细菌中任意一种。

10、优选地，所述重组质粒含有启动子、硫醌氧化还原酶基因sqr和终止子；所述启动子包括p3，所述终止子包括rrnb，所述质粒包括pbbr1mcs。

11、优选地，所述启动子、硫醌氧化还原酶基因sqr和终止子以重叠pcr方式连接。

12、优选地，所述重组质粒的验证方法包括：将重组质粒热转化至大肠杆菌top10感受态细胞中，待长出单菌落后进行菌落pcr，将pcr产物测序后与硫醌氧化还原酶基因sqr序列比对验证，序列一致则说明重组质粒构建成功。

13、优选地，所述初次培养的温度为25-35℃，时间为6-10 h；所述再次培养的温度为25-35℃，时间为5-10 d；所述硫碱弧菌包括多能硫碱弧菌d301菌株。

14、上述25-35℃中的具体点值可以选择25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、32℃、33℃、34℃、34℃、35℃等。

15、优选地，所述碱性碳酸氢钠固体培养基含有na2s2o3·5h2o、nahco3、naoh、nh4cl、kno3、k2hpo4·3h2o、mgcl2·6h2o和琼脂粉；

16、所述碱性碳酸氢钠固体培养基中各成分质量百分比：na2s2o3·5h2o 1.8%-2%、nahco3 5%-6%、naoh 0.2%-1%、nh4cl 0.02%-0.04%、kno3 0.04%-0.06%、k2hpo4·3h2o 0.1%-0.3%、mgcl2·6h2o 0.005%-0.015%和琼脂粉1.5%-3%。

17、优选地，所述碱性nacl培养基溶液含有na2s2o3·5h2o、nacl、naoh、nh4cl、kno3、k2hpo4·3h2o和mgcl2·6h2o；

18、所述碱性nacl培养基溶液中各成分质量百分比：na2s2o3·5h2o 1.8%-2%、nacl2%-4%、naoh 0.2%-1%、nh4cl 0.02%-0.04%、kno3 0.04%-0.06%、k2hpo4·3h2o 0.1%-0.3%和mgcl2·6h2o 0.005%-0.015%。

19、优选地，所述碱性nacl固体培养基含有na2s2o3·5h2o、nacl、naoh、nh4cl、kno3、k2hpo4·3h2o、mgcl2·6h2o、酵母粉和琼脂粉；

20、所述碱性nacl固体培养基中各成分质量百分比：na2s2o3·5h2o 1.8%-2%、nacl2%-4%、naoh 0.2%-1%、nh4cl 0.02%-0.04%、kno3 0.04%-0.06%、k2hpo4·3h2o 0.1%-0.3%、mgcl2·6h2o 0.005%-0.015%、酵母粉0.3%-0.8%和琼脂粉1-3%。

21、优选地，所述构建方法还包括：将构建得到的强化硫氧化功能的硫碱弧菌工程菌进行活化、接种、培养和发酵；所述的培养的温度为25-35℃，转速100-300 rpm。

22、上述25-35℃中的具体点值可以选择25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、32℃、33℃、34℃、34℃、35℃等。

23、上述100-300 rpm中的具体点值可以选择100 rpm、150 rpm、200 rpm、250 rpm、300 rpm等。

24、优选地，所述敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild包括：分别扩增聚硫化物跨膜转运蛋白yild上下游同源臂，经重叠pcr扩增连接上下游同源臂，用限制性内切酶酶切同源臂片段和crisr/ascpf1质粒后t4连接过夜，将连接产物转化至e. coli top10中，采用多寡核苷酸突变的方法，获得连接有yild基因sgrna序列的基因编辑质粒，将基因编辑质粒电转化至大肠杆菌sm10中，利用接合转移将质粒转化至硫碱弧菌中完成敲除。

25、具体地，本发明中敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild的硫碱弧菌工程菌的构建方法包括：

26、使用yild f1/yild r1和yild f2/ yild r2分别扩增yild上下游同源臂，再用引物yild f1/yild r2经重叠pcr扩增连接上下游同源臂，然后用限制性内切酶xbai和ndei（或xhoi酶）切同源臂片段和crisr/ascpf1质粒，t4连接过夜，将连接产物转化至e. colitop10中，获得连接有同源臂的敲除质粒，采用多寡核苷酸突变的方法，反扩上述质粒，胶回收pcr产物，由dpni酶处理后直接转化至e. coli top10中获得连接有yild基因sgrna序列的基因编辑质粒pxhacpf1-δyild。

27、yildf1（seq id no.1）：gctctagatgaagttgatctgttgctggatg。

28、yildr1（seq id no.2）：

29、gcatcggaatacaaccgaattctcggtaaatccgtacacgct。

30、yildf2（seq id no.3）：

31、agcgtgtacggatttaccgagaattcggttgtattccgatgc。

32、yildr2（seq id no.4）：

33、ggaattccatatgagtcttcgtagtcctcgcgc。

34、δyild sgrna序列（seq id no.5）：

35、tttg ctggatgtgcgctcgccgggcga。

36、将质粒pxhacpf1-δyild电转化至大肠杆菌sm10中，利用接合转移将大肠杆菌sm10质粒pxhacpf1-δyild转化至硫碱弧菌中，30℃培养至有单菌落长出时，做菌落pcr鉴定敲除结果。

37、其中，结合转移方法同将sqr基因表达质粒转移至硫碱弧菌。

38、本发明的工程菌通过敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild，提高单质硫产率。相比野生菌，敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild工程菌的单质硫产率提高8%。

39、优选地，所述敲除硫氧化酶soxb包括：分别扩增硫氧化酶soxb上下游同源臂，再经重叠pcr扩增连接上下游同源臂，用限制性内切酶酶切同源臂片段和crisr/ascpf1质粒后t4连接过夜，将连接产物转化至e. coli top10中，采用多寡核苷酸突变的方法，获得连接有硫氧化酶soxb基因sgrna序列的基因编辑质粒，将基因编辑质粒电转化至大肠杆菌sm10中，利用接合转移将质粒转化至硫碱弧菌中完成敲除。

40、具体地，本发明中敲除硫氧化酶soxb的硫碱弧菌工程菌的构建方法包括：

41、使用soxb f1/soxb r1和soxb f2/soxb r2分别扩增soxb上下游同源臂，再用引物soxb f1/soxb r2经重叠pcr扩增连接上下游同源臂，用限制性内切酶xbai和ndei（或xhoi酶）切同源臂片段和crisr/ascpf1质粒，t4连接过夜，将连接产物转化至e. coli top10中，获得连接有同源臂的敲除质粒，采用多寡核苷酸突变的方法，反扩上述质粒，胶回收pcr产物，由dpni酶处理后直接转化至e. coli top10中获得连接有soxb基因sgrna序列的基因编辑质粒pxhacpf1-δsoxb。

42、soxbf1（seq id no.6）：gctctagacatcgaagacgaggtgcagac。

43、soxbr2（seq id no.7）：

44、gtagacggcctcctgggctaacctcgaacgtagtctcgaactg。

45、soxbf2（seq id no.8）：

46、cagttcgagactacgttcgaggttagcccaggaggccgtctac。

47、soxbr2（seq id no.9）：ccgctcgaggctggatgcccatttccttc。δsoxb sgrna序列（seq id no.10）：

48、tttc cgcgaatgccggtgcggtcagca。

49、将质粒pxhacpf1-δsoxb电转化至大肠杆菌sm10中，利用接合转移将大肠杆菌sm10质粒pxhacpf1-δsoxb转化至硫碱弧菌中，30℃培养至有单菌落长出时，做菌落pcr鉴定敲除结果。

50、其中，结合转移方法同将sqr基因表达质粒转移至硫碱弧菌。

51、本发明的工程菌通过敲除聚硫化物跨膜转运蛋白soxb，提高单质硫产率。相比野生菌，敲除聚硫化物跨膜转运蛋白soxb工程菌在气升式反应器中单质硫产率提高11%。

52、第四方面，本发明提供了一种强化硫氧化功能的硫碱弧菌工程菌，所述硫碱弧菌工程菌根据第一方面所述的构建方法构建得到。

53、本发明制备得到的强化硫氧化功能的硫碱弧菌工程菌包括在硫碱弧菌中单独异源表达硫醌氧化还原酶sqr，或单独敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild，或单独敲除硫氧化酶soxb，以及同时进行任何形式的组合操作。

54、第五方面，本发明提供了第二方面所述的强化硫氧化功能硫碱弧菌工程菌在含硫发酵液或含硫气体的脱硫过程中的应用。

55、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

56、（1）本发明的工程菌通过在硫碱弧菌中异源表达硫醌氧化还原酶sqr，敲除聚硫化物跨膜转运蛋白yild和硫氧化酶soxb，提高硫氧化速率和单质硫产率，相比野生菌，在气升式反应器中工程菌的硫化钠氧化速率提高29.2%，单质硫产率提高18%，本发明提升了硫碱弧菌在制药、发酵等行业含硫发酵液、含硫气体处理中应用潜力，拓展了应用范围；

57、（2）本发明中硫碱弧菌工程菌强化了硫氧化功能，无论是在摇瓶培养还是在气升式反应器培养，与野生菌相比，均提高了硫化物氧化速率和单质硫产率，提升了生物脱硫技术的处理效率，进一步降低了运行成本，促进了生物脱硫技术的市场拓展，具有积极的经济意义。