抗犬IL-31单克隆抗体的纯化方法与流程

本申请属于抗体生产，具体地，涉及一种去除包含抗犬il-31单克隆抗体的细胞发酵液上清中的宿主细胞蛋白(host cell protein，hcp)的纯化方法。

背景技术：

1、单克隆抗体药物的研发生产中，除需关注产品的有效性外，还应重点关注其安全性，特别是单克隆抗体生产过程中的宿主细胞蛋白残留是影响单克隆抗体药物安全性的重要因素之一。

2、当前主要是通过中国仓鼠卵巢细胞(cho)等基因工程细胞株发酵生产单克隆抗体，发酵过程中的细胞在不同的生理周期会有凋亡裂解，释放宿主细胞蛋白(host cellprotein，hcp)。hcp诱导机体产生抗hcp抗体，引起过敏反应，严重影响单克隆抗体药物的安全性。因此，在单克隆抗体发酵后的纯化工艺中应尽量去除hcp。

3、一般而言，可以通过对单克隆抗体发酵上清液进行亲和层析以去除其中的hcp。因此，如何优化亲和层析条件，使得能够尽量彻底地去除hcp，这是本领域技术人员面临的一个技术问题。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种去除通过细胞发酵生产的单克隆抗体中的hcp的纯化方法，该纯化方法去除hcp的效果优异。特别是，将其应用于抗犬il-31单克隆抗体的纯化时，经纯化的抗犬il-31单克隆抗体中hcp含量能够低于10ng/ml。

2、即，本发明包括：

3、1.一种抗犬il-31单克隆抗体的纯化方法，其包括以下步骤：

4、a.使用平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡；然后

5、b.将包含抗犬il-31单克隆抗体的细胞发酵上清液上样于亲和层析柱；然后

6、c.再次使用所述平衡缓冲液对所述亲和层析柱进行平衡，直至所述细胞发酵上清液完全流过所述亲和层析柱；然后

7、d.使用淋洗缓冲液对所述亲和层析柱进行淋洗；然后

8、e.再次使用平衡缓冲液对所述亲和层析柱进行平衡；然后

9、f.使用洗脱液对所述亲和层析柱进行洗脱，收集包含抗犬il-31单克隆抗体洗脱峰的洗脱液，从而得到经纯化的抗犬il-31单克隆抗体的溶液；

10、其中，

11、所述平衡缓冲液是100～120mmol/l nacl、50～60mmol/l kcl、10～15mmol/lna2hpo4和20～25mmol/l kh2po4、ph6.5～7.5的水溶液；

12、所述亲和层析柱是蛋白a亲和层析柱；

13、所述淋洗缓冲液是80-110mmol/l柠檬酸钠、120-150mmol/l nacl和5-7mmol/l柠檬酸、ph6.0的水溶液；

14、所述洗脱液是5～8mmol/l乙酸钠和85～95mmol/l乙酸、ph3.2～3.4的水溶液。

15、2.根据项1所述的纯化方法，其中，所述蛋白a亲和层析柱是ge healthcare公司的mabselect tm。

16、3.根据项1所述的纯化方法，其中，平衡缓冲液是100mmol/l nacl、50mmol/lkcl、10mol/l na2hpo4和25mmol/l kh2po4、ph7.0的水溶液。

17、4.根据项1所述的纯化方法，其中，所述淋洗缓冲液是90mmol/l柠檬酸钠、150mmol/l nacl和7mmol/l柠檬酸、ph6.0的水溶液。

18、5.根据项1所述的纯化方法，其中，所述洗脱液是6mmol/l乙酸钠、90mmol/l乙酸、ph3.3的水溶液。

19、6.根据项1所述的纯化方法，其中，所述抗犬il-31单克隆抗体包含重链cdr三个重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，而且

20、cdr-h1的氨基酸序列如seq id no:7，cdr-h2的氨基酸序列如seq id no:8所示，cdr-h3的氨基酸序列如seq id no:9所示；

21、cdr-l1的氨基酸序列如seq id no:10，cdr-l2的氨基酸序列如seq id no:11所示，cdr-l3的氨基酸序列如seq id no:12所示。

22、7.根据项6所述的纯化方法，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

23、所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示；且所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示。

24、8.根据项6所述的纯化方法，其中，所述抗体包含重链和轻链；

25、所述重链的氨基酸序列如seq id no:3所示；且

26、所述轻链的氨基酸序列如seq id no:4所示。

27、9.一种生产抗犬il-31单克隆抗体的方法，其包括采用项1～8中任一项所述的纯化方法对包含所述抗犬il-31单克隆抗体的细胞发酵液上清进行纯化的步骤。

28、本发明的纯化方法能够有效去除hcp，在将其应用于抗犬il-31单克隆抗体的纯化时，经纯化的抗犬il-31单克隆抗体中hcp含量低于10ng/ml。

技术特征：

1.一种抗犬il-31单克隆抗体的纯化方法，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述蛋白a亲和层析柱是ge healthcare公司的mabselect tm。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，平衡缓冲液是100mmol/l nacl、50mmol/lkcl、10mol/l na2hpo4和25mmol/l kh2po4、ph7.0的水溶液。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述淋洗缓冲液是90mmol/l柠檬酸钠、150mmol/l nacl和7mmol/l柠檬酸、ph6.0的水溶液。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述洗脱液是6mmol/l乙酸钠、90mmol/l乙酸、ph3.3的水溶液。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述抗犬il-31单克隆抗体包含重链cdr三个重链互补决定区(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)和三个轻链互补决定区(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)，而且

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

8.根据权利要求6所述的纯化方法，其中，所述抗体包含重链和轻链；

9.一种生产抗犬il-31单克隆抗体的方法，其包括采用权利要求1～8中任一项所述的纯化方法对包含所述抗犬il-31单克隆抗体的细胞发酵液上清进行纯化的步骤。

技术总结本专利申请公开了一种抗犬IL‑31单克隆抗体的纯化方法。该纯化方法包括：A.使用平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡；B.将包含抗犬IL‑31单克隆抗体的细胞发酵上清液上样于亲和层析柱；C.再次使用所述平衡缓冲液对所述亲和层析柱进行平衡，直至所述细胞发酵上清液完全流过所述亲和层析柱；D.使用淋洗缓冲液对所述亲和层析柱进行淋洗；E.再次使用平衡缓冲液对所述亲和层析柱进行平衡；和F.使用洗脱液对所述亲和层析柱进行洗脱，收集包含抗犬IL‑31单克隆抗体洗脱峰的洗脱液，从而得到经纯化的抗犬IL‑31单克隆抗体的溶液。经纯化的抗犬IL‑31单克隆抗体的溶液中的HCP含量可以低于10ng/mL。技术研发人员：秦晓瑞,张久春,方朝东受保护的技术使用者：麦里生物科技（上海）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18