用于处理核酸样品的方法以及核酸样品的组合物与流程

背景技术：

1、核酸测序可用于提供核酸样品的序列信息。这样的序列信息可有助于诊断或治疗对象(例如，个体、患者等)的病况(例如，疾病)。例如，对象的核酸序列信息可以用于鉴定、诊断一种或多种遗传疾病或开发针对一种或多种遗传疾病的治疗。在另一个示例中，一种或多种病原体的核酸序列信息可指引对一种或多种传染性疾病的治疗。

2、一种或多种稀有序列变体(例如，突变)的检测对于医疗保健可以是有价值的。稀有序列变体的检测对于一种或多种病理突变的早期检测可以很重要。在临床样品中检测一种或多种与癌症相关的突变(例如，点突变)可改善化学疗法期间对一种或多种最小残留疾病的鉴定或对复发患者中肿瘤细胞的检测。此外，此类突变检测对于评估暴露于环境诱变剂、监测内源性dna修复或研究衰老个体中一种或多种体细胞突变的积累可以是重要的。检测稀有序列变体可以增强产前诊断并能够表征母体血液中存在的胎儿细胞。

技术实现思路

1、本公开提供了用于处理样品(例如，来源自生物样品的核酸样品)的方法和系统。本公开的一些方面提供了制备用于测序的核酸样品(例如，同时制备可用作用于至少两种不同的测序模式的模板的至少两个不同的核酸分子群体)的方法。在一些实施方案中，至少两种不同的测序模式可以包括短读测序和长读测序。本公开的一些方面提供了对至少两个不同的核酸分子群体进行测序的方法。本公开的一些方面提供了通过本文公开的任何一种方法制备的核酸组合物。本公开的一些方面提供了用于执行本文公开的任何一种方法的系统。

2、在一方面，本公开提供了用于同时生成(i)用于长测序读取(reads)的线性脱氧核糖核酸(dna)模板和(ii)用于高准确率共有序列测序(consensus sequencing)的环状dna模板的文库构建的方法，该方法包括：(a)剪切包含dna分子的样品以生成包含多个dna片段的附加的样品，其中多个dna片段中的dna片段的长度在约0.3千碱基(kb)和约50kb之间；(b)修复dna片段的(1)一个或多个末端和/或(2)一个或多个内部切口(nick)；(c)进行dna片段平末端的加a尾；(d)将衔接子连接至dna片段的每个末端，其中衔接子在特定位置包含一个或多个尿嘧啶；(e)用酶消化一个或多个尿嘧啶以使得dna片段包含互补的黏性末端；(f)在(e)之后，稀释附加的样品，并且将经过稀释的附加的样品在约70℃和约75℃之间的温度加热约5分钟；(g)进行时控冷却，其足以实现(1)多个dna片段中的短dna片段的普遍的环化，其中短dna片段的大小小于大小阈值，同时(2)不利于多个dna片段中的长dna片段的环化，其中长dna片段的大小大于大小阈值；以及(h)进行连接反应以在环化的短dna片段中密封切口，以生成在链中包含缺口(gap)的双链环状测序模板，其中缺口的3’末端充当用于聚合酶合成的引发位点。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，大小阈值是约3千碱基(kb)。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，大小阈值是约2kb。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，大小阈值是约1kb。

3、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，双链环状测序模板的测序从缺口起始。

4、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，未环化的长dna片段的测序通过将引物退火至长dna片段起始。

5、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，所述酶是融合酶，该融合酶包括(i)酶的至少一部分和(ii)另外的酶的至少一部分。

6、在另外的方面中，本公开提供了一种用于处理核酸(na)样品的方法，包括：(a)提供包含第一多个na分子的na样品；(b)将衔接子连接至第一多个na分子中的na分子，以产生第二多个na分子；以及(c)在(b)之后，对第二多个na分子进行热处理，其中热处理足以选择性地环化小于大小阈值的第二多个na分子中的na分子，以产生混合物，该混合物包含环化的na分子以及(i)大于或等于大小阈值并且(ii)未环化的第二多个na分子中的附加的na分子，其中环化的na分子和未环化的附加的na分子均可用于测序。

7、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，大小阈值是约3千碱基(kb)。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，大小阈值是约2kb。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，大小阈值是约1kb。

8、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，热处理足以选择性地环化第二多个na分子中的na分子亚群，其中na分子亚群具有小于大小阈值的平均大小，以产生混合物，该混合物包含各自环化的na分子亚群以及(i)具有大于或等于大小阈值的平均大小并且(ii)各自未环化的附加的na分子亚群。

9、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包括，在(c)之后，对(i)环化的na分子和(ii)未环化的附加的na分子两者进行测序。

10、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，环化的na分子的测序包括合成测序(sequencing-by-synthesis)。在一些实施方案中，环化的na分子包含用于起始合成测序的异源缺口。在一些实施方案中，测序不包括将引物退火至环化的na分子。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，未环化的附加的na分子的测序包括将引物退火至未环化的附加的na分子。

11、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，在(c)中，该方法进一步包括对环化的na分子进行连接反应。

12、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，热处理包括将第二多个na分子在约60℃和约85℃之间的温度加热。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，热处理包括将第二多个na分子在约70℃和约75℃之间的温度加热。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，热处理包括将第二多个na分子加热少于或等于约10分钟。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，热处理包括将第二多个na分子加热少于或等于约5分钟。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，热处理包括将第二多个na分子以约0.1℃/min和约100℃/min之间的速率冷却。

13、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，第一多个na分子的浓度是约0.01nm至约10nm。

14、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，衔接子是异源衔接子。

15、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，(i)环化的na分子包含衔接子或其衍生物并且(ii)线性的附加的na分子包含衔接子或其衍生物。

16、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，衔接子包含一个或多个尿嘧啶。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，衔接子包含第一衔接子和第二衔接子，并且其中该方法进一步包括，在(b)中，(1)将第一衔接子连接至na分子的第一末端以及(2)将第二衔接子连接至na分子的第二末端。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，第一衔接子包含一个或多个尿嘧啶。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，第二衔接子包含一个或多个尿嘧啶。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包括，在连接之后，消化第一衔接子和第二衔接子中的一个或多个尿嘧啶，使得na分子包含互补的黏性末端。

17、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包括，在(b)之前，对na分子进行聚腺苷酸化。

18、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包括，在(b)之前，修复na分子的(1)一个或多个末端和/或(2)一个或多个内部切口。

19、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，第一多个na分子具有在约0.1kb和约200kb之间的平均大小。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，第一多个na分子具有在约0.2kb和约50kb之间的平均大小。

20、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，该方法进一步包括，在(a)中，对初始核酸样品进行na片段化，以生成所述核酸样品。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，na片段化包括na剪切。

21、在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，第二多个na分子包含多个双链na分子。在本文公开的任何一种方法的一些实施方案中，第二多个na分子包含多个脱氧核糖核酸(dna)分子。

22、在另外的方面中，本公开提供了一种包含混合物的组合物，该混合物包含多个核酸(na)分子，其中多个na分子包括：小于大小阈值的na分子，其中第一na分子经由衔接子环化；以及大于或等于大小阈值的附加的na分子，其中附加的na分子未环化并且包含附加的异源衔接子，其中异源衔接子和附加的异源衔接子是基本上相同的，其中环化的na分子和未环化的附加的na分子均可用于测序。

23、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，na分子和附加的na分子两者源自相同的初始na样品。

24、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，附加的na分子包含(1)在附加的na分子第一末端的附加的衔接子和(2)在附加的na分子第二末端的不同的衔接子。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，附加的衔接子和不同的衔接子是相同的。

25、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，大小阈值是约3千碱基(kb)。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，大小阈值是约2kb。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，大小阈值是约1kb。

26、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，多个na分子包含(i)具有小于大小阈值的平均大小的多个环化的na分子，其中多个环化的na分子中的每一个经由衔接子或其衍生物环化，以及(ii)具有大于或等于大小阈值的平均大小的多个未环化的na分子，其中多个未环化的na分子的每一个包含附加的衔接子或其衍生物。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，多个环化的na分子的量是多个na分子的至少约5％。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，多个未环化的na分子的量是多个na分子的至少约5％。

27、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，na分子被衔接用于合成测序。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，na分子包含用于起始合成测序的异源缺口。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，合成测序不包括将引物退火至环化的na分子。

28、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，附加的na分子被衔接用于经由将引物退火至附加的na分子进行测序。

29、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，多个na分子具有在约0.1kb和约200kb之间的平均大小。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，多个na分子具有在约0.3kb和约50kb之间的平均大小。

30、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，多个na分子包含多个双链na分子。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，多个na分子包含多个脱氧核糖核酸(dna)分子。

31、在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，衔接子是异源衔接子。

32、通过以下在其中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案的详细描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。如将认识到的，本公开能够具有其他不同的实施方式，并且其若干细节能够在不脱离本公开的情况下在各种明显的方面进行修改。因此，附图和具体实施方式应被视为本质上是说明性的，而非限制性的。

33、援引并入

34、本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，程度如同具体地和单独地指出要通过引用来并入每一个出版物、专利或专利申请。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相抵触时，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。