一种胶原基双层仿生修复膜、制备方法及应用与流程

本发明涉及组织工程，尤其是涉及一种胶原基双层仿生修复膜、制备方法及应用。

背景技术：

1、近些年来，随着组织工程学的不断发展进步，膜引导组织再生术(membraneguided bone regeneration，mgbr)在很多组织修复治疗中得到广泛应用。

2、例如，口腔修复膜广泛地应用于牙周科、口腔种植及牙槽外科等口腔医学领域。口腔修复膜是利用外科手术的方式将膜置于口腔软组织与骨缺损之间建立生物屏障，以此创造一个相对封闭的骨再生环境，选择性地阻挡迁移速度较快的成纤维细胞和上皮细胞进入骨缺损区，而同时又不妨碍伤口自然愈合的一种生物相容性材料，其作用机制主要是一方面起到机械屏障和诱导作用，将非成骨细胞阻挡在骨缺损区域外，使成骨细胞顺利进入骨缺损区并在其表面贴附，随后增殖分化促进生长因子聚集，进一步促进并提高新骨生成量；另一方面促使新生血管与骨缺损区周围血管进一步吻合，提供完整的供血系统；同时在其生物降解过程中参与代谢，释放骨再生所需微量元素，更进一步促进新骨再生。

3、目前常见的口腔修复膜分为可吸收性膜和不可吸收性膜。不可吸收性膜一般以聚四氟乙烯、钛、硅胶为原料，这种口腔修复膜虽然带来良好的机械性能，但是不可吸收，需进行二次取出；可吸收膜一般以壳聚糖、异体组织、可降解高分子和胶原为原料，壳聚糖类口腔修复膜生物降解性能和机械性能较差，因此不适合作为口腔修复材料；可降解高分子具有良好的机械性能、可降解性和可吸收性，但是降解产物易产生炎症；异体组织和胶原基口腔修复膜可吸收、生物相容性好，具有良好的骨组织诱导再生功能，而且可降解，因此在临床上应用广泛。

4、膜引导组织再生术除了用于制备口腔修复膜，还有望用于其他修复产品，例如，肩袖损伤是骨外科最常见肌腱损伤之一，由于肌腱固有的不良再生能力，其自然愈合过程中常常形成瘢痕组织，降低了肌腱整体机械性能，损伤肌腱往往发生再次撕裂。据统计，肩袖全层损伤在＞60岁人群中的发病率为28～40％，由于受年龄、损伤面积、肌肉萎缩、肌腱退变、脂肪变性、术后康复锻炼等因素的影响，肩袖修补手术失败率为20～70％，其中肩袖修补术后肌腱与骨交界面处(腱-骨界面)不易愈合是导致手术失败的主要原因之一。目前可采用肩袖补片对交界面进行加强，常用的肩袖补片材料包括合成材料和生物材料。合成材料具有良好的力学强度，但生物相容性较差；生物材料具有良好的生物相容性，但是生物材料中的自体移植材料取材有限，其他生物材料力学强度无法满足肩袖的力学负荷强度。而且，目前的肩袖补片都不具有良好的组织再生性。

5、再例如，脑外伤、脑肿瘤及脑血管病甚至进行开颅手术时必须切开硬脑膜.切开后的脑膜出血需要电凝止血，有时肿瘤侵入硬脑膜，需要作脑膜切除；外伤性脑膜损伤等，常导致脑膜缺损，使脑、脑脊液得不到有效保护。由于脑膜缺损引起的脑的医源性损伤、脑脊液漏，颅内感染等并不少见。而在脊柱外科手术中，同样也出现硬脊膜的损伤及术后脑脊液渗漏的并发症，如果处理不当可引起切口的长期不愈合、局部感染，严重者可引起椎管内及颅内感染,甚至危及生命。因此在神经外科手术和脊柱外科手术中，应用一种能够防水密封的材料修复缺损的硬脑膜和硬脊膜非常重要。

6、虽然医生在手术中常利用自体颅骨骨膜，颞肌筋膜、帽状腱膜，阔筋膜等修补硬脑脊膜缺损，但是由于花费时间长，增加新的创伤.有时这些组织自身受到损伤或面积太小而不能被利用，并且自身组织的移植需要术前规划，第二个手术部位需要提前准备.增加手术和麻醉时间，以及产生新的创伤。故需要开发一种合适的硬脑脊膜修复材料，以满足临床需要。硬脑脊膜修复材料除了自身组织之外，鉴于资源生物安全性和经济性等考虑，人们密切关注同种异体修复材料、异种修复材料，合成修复材料和天然修复材料的开发和应用研究。

7、同种异体修复材料由于材料来源易受限制、容易存在蛋白病毒，并且价格比较昂贵，因此在临床中已被禁用。而合成修复材料不能与组织良好结合，具有降解性的材料降解产物还极有可能发生炎症反应，同时需要缝合，因此在临床上也被拒绝使用。目前临床应用较多的为异种硬膜脊膜修复材料和天然硬脑脊膜修复材料，多采用动物心包膜、小肠粘膜下层和从动物肌腱提取的可降解胶原基质材料。

8、可见，目前采用的几种脑膜都存在这各种缺陷，而组织再生术有望应用于脑膜的制备中，制备出一种能够取代目前所应用的脑膜。

9、另外，肩袖损伤也是骨外科最常见肌腱损伤之一，由于肌腱固有的不良再生能力，其自然愈合过程中常常形成瘢痕组织，降低了肌腱整体机械性能，损伤肌腱往往发生再次撕裂。据统计，肩袖全层损伤在＞60岁人群中的发病率为28-40％，由于受年龄、损伤面积、肌肉萎缩、肌腱退变、脂肪变性、术后康复锻炼等因素的影响，肩袖修补手术失败率为20-70％，其中肩袖修补术后肌腱与骨交界面处(腱-骨界面)不易愈合是导致手术失败的主要原因之一。目前可采用肩袖补片对交界面进行加强，常用的肩袖补片材料包括合成材料和生物材料。合成材料具有良好的力学强度，但生物相容性较差；生物材料具有良好的生物相容性，但是生物材料中的自体移植材料取材有限，其他生物材料力学强度无法满足肩袖的力学负荷强度。而且，目前的肩袖补片都不具有良好的组织再生性。急需一种同时具有良好力学性能和生物学性能的生物材料，应用于肩袖补片的制备之中。

10、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种胶原基双层仿生修复膜，能够满足口腔修复膜、脑膜和肩袖补片的要求，在满足力学性能要求的情况下，取得更加优异的诱导再生效果。

2、本发明另一个目的在于提供上述胶原基双层仿生修复膜的制备方法，该方法应当力求精简节时，适于批量生产，成本不宜过高，具备显著的经济效益。

3、最后，本发明的目的还在于，上述的胶原基双层仿生修复膜和胶原基双层仿生修复膜的制备方法能够成功地应用于制备硬组织修复产品中，例如口腔修复膜、脑膜或肩袖补片，以缓解了目前采用的修复材料中存在的各种技术问题。

4、第一方面，本发明提供一种胶原基双层仿生修复膜，包括具有孔结构的第一膜层和具有孔结构的第二膜层，所述第一膜层的孔隙率小于20％，第二膜层孔隙率为90％～99％，所述第一膜层包括天然高分子或天然高分子的衍生物，所述天然高分子包括纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶、丝素蛋白、淀粉或ι型胶原中的一种，所述第二膜层包括ι型胶原，所述第二膜层嵌入第一膜层的孔结构中，所述第一膜层的厚度为0.1～1.0mm，所述第二膜层的厚度为0.9～4mm。

5、第二方面，本发明提供前述实施方式所述的胶原基双层仿生修复膜的制备方法，向具有孔结构的第一膜层表面加入ι型胶原溶液，经脱气后，在振荡条件下，采用冷冻干燥制备第二膜层。

6、在可选的实施方式中，所述第一膜层的制备方法包括，天然高分子溶液或天然高分子衍生物的溶液经梯度冷冻干燥后，得到孔隙率为90％～99％的多孔材料，再压制成型得到第一膜层；

7、优选地，所述多孔材料的孔隙率为95％～98％；

8、优选地，所述天然高分子包括纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶、丝素蛋白、淀粉或ι型胶原中的一种；

9、优选地，所述天然高分子为ι型胶原；

10、优选地，所述ι型胶原的制备方法包括：粉碎的牛跟腱经过酸溶液浸泡后，使用胃蛋白酶的酸溶液进行酶处理，处理完成后，在碱性环境下加入盐离子沉淀得到ι型胶原粗提物，经酸中和、过滤和干燥，得到ι型胶原。

11、在可选的实施方式中，所述梯度冷冻干燥至少依次包括三个梯度的冷冻干燥步骤，其中第一梯度冷冻干燥温度为-40℃～-10℃，保温时间为1～6h，第二梯度冷冻干燥的温度为-10℃～0℃，保温时间为12～48h；第三梯度冷冻干燥的温度为20～25℃，保温时间为20～30min(第三梯度冷冻干燥为解吸干燥，此步主要是为了去除部分靠范德华力和氢键吸附在样品上的结合水以降低其含水率)；

12、优选地，所述第一梯度冷冻干燥的温度为-30℃～-20℃；

13、优选地，所述第二梯度冷冻干燥的保温时间为20～30h。

14、在可选的实施方式中，所述压制成型的压合时间为5～60min，所述压制成型的压合力为0.4～0.8mpa。

15、在可选的实施方式中，所述第二膜层成型制备完成后，对得到的胶原基双层仿生修复膜进行热处理，能够实现胶原基双层仿生修复膜内组分的干热交联，经过热处理的胶原基双层仿生修复膜具有良好的尺寸稳定性和热稳定性，在润湿状态下依然保持自身的固有形状，不会发生塌陷等不良现象，同时热处理工艺还可在冷冻干燥的基础上进一步控制胶原基双层仿生修复膜的孔径和孔隙率，从而调控胶原基双层仿生修复膜的耐降解性能和力学性能。

16、优选地，所述热处理的步骤包括将得到的胶原基双层仿生修复膜于110～130℃条件下保温24～36h；

17、优选地，所述热处理的温度为110～120℃；

18、优选地，所述热处理的同时对于胶原基双层仿生修复膜进行压合；

19、优选地，所述压合的压合力为0.4～0.8mpa。

20、在可选的实施方式中，所述第一膜层和第二膜层均由ι型胶原溶液制备而得。

21、优选地，所述ι型胶原溶液包括溶有ι型胶原的醋酸溶液，所述溶有ι型胶原的醋酸溶液中ι型胶原的质量百分比为0.1％～2％，所述醋酸溶液包括醋酸的水溶液，所述醋酸的水溶液中醋酸的浓度为0.025～1mol/l。

22、优选地，所述溶有ι型胶原的醋酸溶液中ι型胶原的质量百分比为0.5％～1.5％。

23、优选地，所述醋酸的水溶液中醋酸的浓度为0.4～0.8mol/l，采用该浓度的醋酸溶液，对已干燥好的胶原纤维进行溶解，使获得的胶原溶液中胶原纯度更高，纤维舒展性更好，分布更均匀。

24、在可选的实施方式中，所述脱气的方法包括抽真空。

25、优选地，所述抽真空的条件包括，在0.06～0.09mpa真空度下静置30～60min。

26、在可选的实施方式中，所述第二膜层的冷冻干燥至少依次包括第四梯度冷冻干燥和第五冷冻干燥，所述第四梯度冷冻干燥的温度为-40℃～-10℃，保温时间为1～6h，第五梯度冷冻干燥的温度为-10℃～0℃，保温时间为12～48h；

27、优选地，所述第四梯度冷冻干燥的温度为-30℃～-20℃；

28、优选地，所述第五梯度冷冻干燥的保温时间为20～30h；

29、优选地，所述振荡条件包括超声振荡。

30、第三方面，本发明提供前述实施方式所述的胶原基双层仿生修复膜或应用前述实施方式任一项所述的制备方法得到的胶原基双层仿生修复膜在制备硬组织修复产品中的应用。

31、优选地，所述硬组织修复产品包括口腔修复膜、脑膜或肩袖补片。

32、本发明提供的胶原基双层仿生修复膜具有致密的第一膜层和疏松的第二膜层，致密的第一膜层可以起到机械屏障的作用，阻挡成纤维细胞过快进入缺损区域，而疏松的第二膜层依然具有仿生三维多孔结构，因此具有较高的孔隙率、孔连通率和适宜的孔径，有利于细胞的粘附和增殖分化，同时采用天然高分子或其衍生物和ⅰ型胶原为原材料，能够很好地实现诱导组织再生，此外ⅰ型胶原还具有可降解功能。

33、本发明提供的上述胶原基双层仿生修复膜的制备方法包括向具有孔结构的第一膜层表面加入ι型胶原溶液，经脱气后，在振荡条件下，采用冷冻干燥制备第二膜层，工艺简单、适于工业生产，原料常见、低廉，具有较高经济效益，同时，在不引入交联剂的前提下，明显提高了胶原基双层仿生修复膜的机械性能、延长降解时间。另外，在已经成型的具有孔结构的第一膜层表面加入ι型胶原溶液，能够使上层的ι型胶原溶液渗入第一膜层的孔隙中，既可降低第一膜层的孔隙率，又可提高两层之间的连接强度，而冷冻干燥步骤可以实现对胶原基双层仿生修复膜的孔径和孔隙率的控制，从而调控胶原口腔修复膜的耐降解性能和力学性能。此外，所述的振荡条件下进行冷冻干燥，能够防止冷冻干燥过程中气泡的产生。