一种Menkes病动物模型的构建方法及应用

本发明属于生物，涉及一种menkes病动物模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、menkes病(menkes disease，md)，也叫menkes综合征，是由于atp7a基因突变或缺失引起的x染色体连锁的遗传病，是典型的铜缺乏导致的神经功能缺陷疾病。md的临床症状主要有：低体温、色素减退、毛发卷曲、动脉曲张、肌肉张力减退、癫痫、发育障碍等。md疾病模型使用atp7a基因全身敲除会导致胚胎致死。目前使用最为广泛的md模型是mottled鼠(斑点鼠)。mottled鼠通过自然突变、化学诱变、离子辐射诱变等方式产生，其在atp7a基因位点的突变类型多样，因此其存活情况也呈现多样化：子宫内死亡到出生后2周死亡。mottled鼠存在遗传背景复杂、表型差异大、繁殖慢(纯合子无法发育到性成熟)等劣势，严重阻碍了针对md的治疗方案的研发。

2、wilson病(wilson’s disease,wd)，也叫肝豆状核变性，是由于atp7b基因突变或缺失引起的常染色体隐性遗传病，是典型的铜淤积导致的肝脏功能受损进而危害全身器官的铜代谢紊乱疾病。atp7b基因在人群中的突变具有明显的地域特性。在欧洲，atp7b基因突变类型主要为14号外显子上的c.3207c>a，对应的atp7b蛋白突变为h1069q；而在亚洲区域，最广泛的突变类型为8号外显子上的c.2333g>t，对应的atp7b蛋白突变为r778l。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下的技术方案：

2、本发明提供了一种menkes病动物模型的构建方法，所述构建方法步骤如下：亲本雌性wilson病动物与亲本雄性野生型动物繁殖，得到的f1代子代即为menkes病动物模型。

3、进一步，所述动物选自非人哺乳动物。

4、进一步，所述哺乳动物包括啮齿动物、食肉动物、翼手动物、猬形动物、食虫动物。

5、进一步，所述哺乳动物选自啮齿动物。

6、进一步，所述啮齿动物包括丽仓鼠科、仓鼠科、鼠科、马岛鼠科、刺山鼠科、鼹鼠科、棘鼠科、岩鼠科。

7、进一步，所述啮齿动物选自鼠科。

8、进一步，所述鼠科包括黑鼠、褐鼠、沙鼠、新世界大鼠、旧世界大鼠、sd大鼠、波利尼西亚大鼠、树大鼠、木头大鼠、棍棒大鼠、稻米大鼠、袋鼠大鼠、攀鼠、鼩小鼠、斯里兰卡小鼠、锡金小鼠、爪哇小鼠、印度小鼠、田鼷鼠、褐小鼠、库氏小鼠、塞浦路斯小鼠、南印小鼠、泰国小鼠、南斯拉夫小鼠、小家鼠、缅甸鼷鼠、匈牙利小鼠、地中海小鼠、土色小鼠、科特迪瓦小鼠、蟾小鼠、安哥拉小鼠、岗地小鼠、博茨瓦纳小鼠、衣冠小鼠、索马里小鼠、加纳小鼠、南非小鼠、可喜小鼠、鼩形小鼠、山谷小鼠、中非小鼠、刚毛小鼠、赞比亚小鼠、乌干达小鼠、娇小鼠、海神小鼠、弗氏小鼠、菲氏小鼠、扁毛小鼠、岩洞小鼠、肖氏小鼠。

9、在一些实施方案中，啮齿动物选自鼠总科。在一些实施方案中，所述丽仓鼠科包括但不限于丽仓鼠、巴氏丽仓鼠、古氏丽仓鼠、锦丽仓鼠、郝氏丽仓鼠、髯丽丽仓鼠、楚氏丽仓鼠、乌拉特丽仓鼠。

10、在一些实施方案中，所述仓鼠科包括但不限于黑线仓鼠、田鼠、冠鼠。

11、在一些实施方案中，所述马岛鼠科包括但不限于长尾巨鼠、南非囊鼠、非洲巨鼠、马岛白尾鼠。

12、在一些实施方案中，所述刺山鼠科包括但不限于刺山鼠、猪尾鼠。

13、在一些实施方案中，所述鼹鼠科包括但不限于鼹鼠、竹鼠和鼢鼠。

14、在一些实施方案中，所述刺鼠科包括但不限于长指鼠属、苇棘鼠属、盔棘鼠属、箭毛棘鼠属、中棘鼠属、地棘鼠属、隐棘鼠属、强齿棘鼠属、喜棘鼠属、宽弓棘鼠属、棘鼠属、树棘鼠属、匀棘鼠属、胄树棘鼠属、红冠树鼠属、古巴穴鼠属、可食鼠属、穴鼠属、科罗萨尔鼠属的鼠种。

15、在一些实施方案中，所述岩鼠科包括但不限于非洲岩鼠的各种亚种。

16、进一步，所述wilson病动物是atp7b基因突变后表达的蛋白功能缺失导致的。

17、在一些实施方案中，所述atp7b基因突变后表达的蛋白功能缺失导致动物出现wilson病，具体表现为典型的铜淤积导致的肝脏功能受损进而危害全身器官的铜代谢紊乱。

18、atp7b被称为atpase铜转运β，人源atp7b基因id为540。atp7b基因在进化上高度保守，氨基酸序列在各物种间同源性很高。小鼠atp7b基因id为11979，包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变等。该术语“atp7b”涵盖不同物种全长，未加工的基因或蛋白，以及源自细胞中加工的任何形式的基因或蛋白。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体。gene id可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。

19、进一步，所述atp7b基因突变使用基因敲除技术。

20、进一步，所述基因敲除技术包括crispr/cas9技术。

21、进一步，所述atp7b基因突变后表达的蛋白为与人atp7b蛋白p.h1069q同源的位置的突变。

22、进一步，所述atp7b基因突变后表达的蛋白为与人atp7b蛋白p.r778l同源的位置的突变。

23、在一些实施方案中，所述atp7b基因突变后表达的蛋白功能缺失，不同的物种之间的突变会存在同源性，以通过常规的同源性比对技术为准。在一些实施方案，突变有自然突变、化学诱变、离子辐射诱变等多种方式，突变也可通过crispr/cas9技术等基因敲除技术进行敲除获得。在一些实施方案中，所述基因敲除技术导入细胞的方式包括电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、deae葡聚糖法、显微注射、病毒感染。在一些实施方案中，所述导入细胞时使用的载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、噬菌体、质粒。

24、进一步，所述atp7b基因突变为与人atp7b基因c.3207c>a同源的位置的突变。

25、进一步，所述atp7b基因突变为与人atp7b基因c.2333g->t同源的位置的突变。

26、进一步，所述atp7b基因突变后表达的蛋白为非人动物野生型atp7b蛋白发生p.r780l的突变。

27、进一步，所述atp7b基因突变后表达的蛋白如seq id no:1所示。

28、进一步，所述seq id no:1如下，突变位点p.r778l使用加粗下划线表示：

29、

30、

31、进一步，所述atp7b基因突变为非人动物野生型atp7b基因发生c.2339g->t的突变。

32、进一步，所述atp7b基因突变后编码蛋白的核苷酸序列是经过密码子优化的。

33、密码子优化方法在本领域中已知并且可如本文提供来使用。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配标靶与宿主有机体中的密码子频率来确保适当折叠；使gc含量出现偏差来增加mrna稳定性或减少二级结构；使可损害基因构造或表达的串联重复密码子或碱基运行最小化；定制转录和转译控制区；插入或去除蛋白运输序列；去除/添加编码蛋白中的转译后改性位点(例如，糖苷化位点)；添加、去除或取代蛋白结构域；插入或删除限制位点；改性核糖体结合位点和mrna降解位点；调节转译速率以使得蛋白的各种结构域可适当折叠；或减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。

34、进一步，所述atp7b基因突变的8号外显子的核苷酸序列如seq id no:2所示，其余核苷酸序列与野生型atp7b基因序列相同。

35、进一步，所述seq id no:2如下，突变位点c.2339g->t使用加粗下划线表示：

36、

37、进一步，所述亲本雌性wilson病动物的年龄为6-8周。

38、在一些实施方案中，所述亲本雌性wilson病动物的年龄对f1代子代的menkes病疾病模型的产生具有重要影响，年龄的具体取值需与人类整体寿命进行类比，以小鼠为例，小鼠月龄和人类年龄有一定的对应关系，在小鼠出生到1月龄之间，小鼠的生长速度是人类的150倍；在小鼠1-6月龄之间，小鼠的生长速度是人类的45倍；在小鼠6月龄以后，小鼠的生长速度是人类的25倍，因此小鼠的6-8周龄对应人类年龄在14-16岁的阶段。在本发明的实施方案中，所述亲本雌性wilson病动物的年龄最优为6-8周(对应人类年龄在14-16岁)，但不意味着其他年龄的亲本雌性wilson病动物无法产生f1代子代的menkes病疾病模型，仅出现生产效率的下降。

39、进一步，所述构建方法还可直接使用亲本雌性wilson病动物的卵子与野生型动物的精子培育受精卵，并将受精卵转移至其他适宜孕龄的同种雌性动物子宫内培育f1代子代。

40、在一些实施方案中，对于不易得到的非人类动物，可以采取其他方法来制造包含前述基因突变修饰的非人类动物。所述方法包括例如使用基因突变技术修饰非人类动物的细胞基因组，并且采用体细胞核转移的方式将基因突变修饰的基因组转移至合适的细胞中，例如该非人类动物的去核卵母细胞，并且在合适的条件下在非人类动物中孕育修饰的细胞以形成胚胎。

41、进一步，所述f1代子代出生即全身铜含量显著降低。

42、进一步，所述f1代子代具有毛发松散，色泽暗淡，胡须卷曲；有明显的色素减退；体温偏低；发育障碍的menkes病典型症状。

43、本发明提供了一种利用前面所述的构建方法产生的动物模型筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向所述动物模型施用所述一种或多种候选物质。

44、进一步，所述方法包括以下步骤：

45、向前面所述的构建方法产生的动物模型使用候选物质，检测模型动物使用候选物质后是否有menkes病相关症状的变化，当使用候选物质对menkes病相关症状具有治疗效果时，将所述候选物质鉴定为menkes病的治疗剂。

46、本发明提供了一种利用前面所述的构建方法产生的动物模型测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。

47、进一步，所述药物包括一种或多种药学上可接受的辅料。

48、进一步，所述辅料包括但不限于黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、软膏剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。

49、本发明提供了一种前面所述的构建方法产生的动物模型和/或动物模型中分离的细胞或组织在menkes病病理研究方面的应用。

50、本发明提供了一种利用前面所述的构建方法产生的动物模型中分离的细胞或组织筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向细胞或组织施用所述一种或多种候选物质。

51、本发明提供了一种前面所述的构建方法产生的动物模型和/或动物模型中分离的细胞或组织在评估治疗menkes病的产品的治疗疗效中的应用。

52、进一步，所述应用中评估治疗menkes病的产品的治疗疗效的步骤包括：

53、向前面所述的构建方法产生的动物模型和/或动物模型中分离的细胞或组织中使用想要评估治疗疗效的产品，评价在使用产品后的模型上观察到的效果。

54、根据本发明的部分实施例，要观察的所述效果是指生理病理变化。具体的，所述生理病理变化只要发生部分即可，这意味着生理病理变化的某一部分发生了改善，在这种结果的基础上，则可评价产品的治疗疗效。在某些情况下，生理病理未发生任何变化，则产品的治疗疗效不存在。

55、在一些实施方案中，本发明中筛选得到的治疗剂或测定的药物优选在药学上可接受的媒介物中施用。合适的药物媒介物是本领域技术人员已知的。例如在肠胃外给药时，通常使用溶解或悬浮于无菌水或盐水的方式中进行施用；在肠内施用时，通常使用片剂、液体或胶囊的形式包裹有效成分进行施用。在一些实施方案中，所述治疗剂或药物是缓释的，持续释放的或短时释放的。

56、本发明中使用的术语“同源”、“同源性”是指聚合物分子，例如，在核酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或在多肽分子之间的总体相关性。通常，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本发明的背景下，术语“同源性”包括同一性和相似性。

57、在一些实施方案中，“同源性”可使用本领域已知的方法(诸如，序列比较算法)确定，当在比较窗口上以最大一致性比较和对齐时，两个或多个序列具有指定百分比的在指定区域上相同的核苷酸。在一些实施方案中，如果分子中至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的单体是相同的(完全相同的单体)或相似(保守置换)，聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。

58、本发明中使用的术语“非人类动物”与“非人类动物模型”是指具有或显示出疾病或病状的特征的非人类动物。动物模型的用途是指动物模型用于研究疾病或状况的任何用途，例如科研、疗法、疗法反应等的用途。

59、本发明中使用的术语“治疗”是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。

60、本发明中使用的术语“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸”可互换使用，并且是指分别含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸分子、dna或rna。核酸可以是双链的、单链的、或包含双链或单链序列的部分。

61、本发明中使用的术语“表达”是指将多核酸转录成mrna并翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。

62、本发明的非人类动物可用于体内试验。另外，本发明的非人类动物可以用作体细胞、胎儿或胚胎细胞的来源，一旦分离并培养，就可以用于体外测试。另外，如果需要，可以使用常规技术从所述细胞制备永生化细胞系。因此，另一方面，本发明提供了衍生自本发明非人类动物的分离的细胞系。

63、本发明中使用的术语“f1代子代”是指由雌性纯合wilson病亲本与雄性野生型亲本繁殖得到的后代，在本发明的具体实施方案中，f1代子代仅代表第一代子代。在一些实施方案中，使用雌性纯合wilson病亲本的卵子，雄性野生型亲本的精子进行体外受精，也可以得到本发明非人类动物模型。在一些实施方案中，所述非人类动物模型的获得只要在常规方法例如经典杂交技术、体外受精、合笼交配等即可，对于受精卵孕育母体的选择并不存在除物种以外的限制。

64、本发明的优点和有益效果：

65、本研究首次提出将wilson病小鼠模型纯合雌鼠与野生型雄鼠的子代作为menkes病模型这一概念，并系统评估了a7b-r780l-hop作为md疾病模型的可信性，该模型具有遗传背景清晰单一、操作窗口明确、繁殖快等优势，有望揭示新的md发病机制，助力md的临床治疗。