Ras信号通路激活促进轴突再生和视神经节细胞的存活

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及ras信号通路激活促进轴突再生和视神经节细胞的存活。

背景技术：

1、ras蛋白为多种生长因子信号转导过程所共有，总称为ras信号通路。可能涉及到诸多生长相关因子，如：egf、pdgf、fgf等。ras蛋白是癌基因las的编码产物，人类有3种ras基因，即h-ras、k-las和n-fas，主要通过与gtp结合产生活性，在众多癌症相关研究中已经得到广泛研究，但在与神经再生的研究中却较少涉及。

2、有限的轴突再生是神经系统病变后功能恢复的主要障碍。细胞生长途径的激活，包括pi3k和哺乳动物靶点拉帕霉素(mtor)，已在不同的实验系统包括在成年哺乳动物中枢神经系统(cns)的神经元中被证明可促进轴素再生。令人惊讶的是，在提高mtor活性后，只有α类型的视网膜结节细胞(rgcs)能够做到轴突再生，而其他类型的rgc不能再生。这种神经元类型特异性轴突再生代表了调节轴突再生的一个新的机制层面，同时这也是一种普遍现象，因为在包括果蝇和c.elegans等其他物种的cns以及周围神经系统(pns)中也可以观察到。然而，控制这种轴突再生的特异性机制定义并不明确，缺乏概念框架：再生特异性是由神经元类型之间的内在差异、神经元和周围细胞之间的不同相互作用决定的，还是两者兼而有之。解决这些问题可能会揭示神经元如何对不同的伤害做出反应这一根本问题。此外，从再生神经元中识别再生程序并在非再生神经元中激活它们是一个很有前途的修复策略。

3、神经胶质与神经元密切相互作用，以维持神经回路的功能和代谢平衡。此外，胶质细胞调控轴突再生。一些胶质细胞-神经元之间的相互作用，例如胶质疤痕形成和骨髓相关因子，已经在轴突再生中得到了广泛的研究。其他形式的胶质-神经元相互作用也存在。其中一个例子是胶质细胞的化学因子传输(又名胶质转递)，通过这个过程，胶质钙离子增多触发小分子化学递质(又名胶质递质)的释放，包括atp及其代谢产品腺苷、谷氨酸和d-serine。这些胶质递质作用于神经元受体，以调节从突触可塑性到行为的神经元功能。然而，对于胶质传递在轴突再生中的作用知之甚少。

4、神经元活动和ca2+信号调节轴突再生。通过完全以设计药物为基础的化学遗传学激活的设计受体(dreadd)，通过异位激活褪色素-gq信号通路，或通过沉默上游抑制性阿马林细胞来增加神经元活性，从而促进小鼠rgc的轴突再生。此外，轴切除术后的即时ca2+瞬态作为早期损伤信号，在轴突再生的早期阶段发挥广泛功能，包括细胞膜重新封闭、生长锥形成、从损伤部位向细胞体的逆行信号以及表观遗传前体的激活。然而，是否存在其他形式的ca2+信号，以及神经元活动和ca2+信号是否可以调节神经元类型中轴突再生的特异性尚不得而知。

5、果蝇幼虫pns中的感官神经元已成为研究神经元再生各个方面的强大实验模型。根据它们定义明确的树突形态和感官功能，这些感官神经元被分为不同的神经元类型。胶质细胞通过髓鞘化轴突束与幼虫感觉神经元进行物理相互作用。与小鼠rgc一样，不同类型的果蝇幼虫感觉神经元具有各自的的轴素再生能力。

6、因此，本领域迫切需要开发一种促进轴突再生和成年小鼠rgc的存活的新方法。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种促进轴突再生和成年小鼠rgc的存活的新方法。

2、本发明的另一目的在于提供激活ras信号通路可以促进轴突再生和视神经节细胞的存活。

3、本发明的另一目的在于提供本发明的方法中ras信号通路的激活依赖腺苷受体激活。

4、本发明的另一目的在于提供本发明的方法激活ras信号通路的机制，腺苷受体激活神经元活性(簇状放电)促进ca2+释放导致ras信号通路激活。

5、本发明的第一方面提供了一种ras信号通路激动剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)促进神经元轴突再生和神经元存活；和/或(b)治疗中枢神经损伤疾病。

6、在另一优选例中，所述促进神经元轴突再生和神经元存活为通过改变神经细胞的放电模式而促进神经元轴突再生和神经元存活。

7、在另一优选例中，所述神经细胞的放电模式被改变为簇状放电模式。

8、在另一优选例中，所述簇状放电模式具有选自下组的一种或多种指标：

9、(1)7.3±4.1个动作电位/簇(action potential/burst)，4.2±2.9个簇状放电/分钟(bursts/minute),40.8±23.3毫秒放电间隔(ms，inter-spike interval)；

10、(2)每15s给予300ms的高频80-100hz放电；

11、(3)每分钟给予5s波宽0.1ms～0.5ms波宽的50hz-100hz的刺激；

12、(4)持续给予10hz-30hz，载有波宽1ms，载波频率3khz-10hz的刺激。

13、在另一优选例中，所述中枢神经损伤疾病包括视神经损伤。

14、在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：

15、(vii)促进ras信号通路激活；

16、(viii)促进神经元的轴突再生；

17、(ix)促进哺乳动物神经节细胞存活；

18、(x)增加轴突切断的神经元中钙离子尖峰的频率；

19、(xi)诱发神经元的自发神经元活动；

20、(xii)诱发胶质传递。

21、在另一优选例中，所述神经元选自下组：视神经元、外周感觉c4da神经元、c3da神经元、或其组合。

22、在另一优选例中，所述神经节细胞包括视网膜神经节细胞。

23、在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

24、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

25、在另一优选例中，所述ras信号通路激动剂选自下组：小分子化合物、表达ras的载体、表达腺苷受体的载体和腺苷受体激动剂、或其组合。

26、在另一优选例中，所述腺苷受体包括adora2b。

27、在另一优选例中，所述腺苷受体激动剂选自下组：腺苷及其功能类似物类伽腺苷。

28、在另一优选例中，所述表达ras的载体和表达腺苷受体的载体各自独立的包括相关生物载体。

29、在另一优选例中，所述相关生物载体包括病毒载体。

30、在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：腺相关病毒载体、慢病毒载体、或其组合。

31、在另一优选例中，所述激动剂包括促进ras表达或活性的物质。

32、在另一优选例中，所述激动剂包括促进腺苷受体表达或活性的物质。

33、在另一优选例中，所述促进腺苷受体表达或活性指将腺苷受体基因或蛋白的表达或活性提高≥10％，较佳地，≥20％，更佳地，≥70％。

34、在另一优选例中，所述促进ras表达或活性指将ras基因或蛋白的表达或活性提高≥10％，较佳地，≥20％，更佳地，≥70％。

35、在另一优选例中，所述的ras蛋白来源于哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。

36、在另一优选例中，所述ras蛋白还包括ras蛋白的衍生物。

37、在另一优选例中，所述ras蛋白的衍生物包括经修饰的ras蛋白、氨基酸序列与天然ras蛋白同源且具有天然ras蛋白活性的蛋白分子、ras蛋白的二聚体或多聚体、含有ras蛋白氨基酸序列的融合蛋白。

38、在另一优选例中，所述经修饰的ras蛋白是peg化的ras蛋白。

39、在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然ras蛋白同源且具有天然ras蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与ras蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然ras蛋白活性的蛋白分子。

40、在另一优选例中，所述ras包括野生型和突变型。在另一优选例中，所述突变型包括ras基因突变，如rasca(活性ras突变)。

41、在另一优选例中，ras包括h-ras、和n-ras基因或其编码蛋白。

42、在另一优选例中，所述ras为h-ras。

43、在另一优选例中，所述ras包括h-rasca、h-ras-i、h-ras-2。

44、在另一优选例中，所述ras信号通路激动剂选自下组：ml-097(cid-2160985)、ml-099(cid-888706)、或其组合。

45、在另一优选例中，所述的腺苷受体包括全长蛋白或蛋白片段。

46、在另一优选例中，所述腺苷受体来源于哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。

47、在另一优选例中，所述腺苷受体还包括腺苷受体的衍生物。

48、在另一优选例中，所述腺苷受体的衍生物包括经修饰的腺苷受体、氨基酸序列与天然腺苷受体同源且具有天然腺苷受体活性的蛋白分子、腺苷受体的二聚体或多聚体、含有腺苷受体氨基酸序列的融合蛋白。

49、在另一优选例中，所述经修饰的腺苷受体是peg化的腺苷受体。

50、在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然腺苷受体同源且具有天然腺苷受体活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与腺苷受体相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然腺苷受体活性的蛋白分子。

51、在另一优选例中，所述腺苷受体选自下组：

52、(a)氨基酸序列如seq id no.:1或2所示的多肽；

53、(b)将seq id no.:1或2所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的腺苷受体的衍生物，或其活性片段；

54、(c)序列与seq id no.:1或2所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的腺苷受体的衍生物，或其活性片段。

55、在另一优选例中，组合物包括药物组合物。

56、在另一优选例中，所述组合物包含(a)ras信号通路激动剂；和(b)药学上可接受的载体。

57、在另一优选例中，所述组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的组分(a)，按组合物的总重量计。

58、在另一优选例中，所述组合物还包括pten抑制剂。

59、在另一优选例中，所述pten抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microrna、sirna、shrna、反义寡核苷酸、核酸适配体、crispr试剂、或其组合，优选shrna。

60、在另一优选例中，所述组合物还包括其他的(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病的药物。

61、在另一优选例中，所述其他的(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病的药物包括：腺苷。

62、在另一优选例中，所述组合物或制剂在(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病的应用中，可单独使用，或联合使用。

63、在另一优选例中，所述的联合使用包括：与pten抑制剂和/或其他的(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病的药物联合使用。

64、在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。

65、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。

66、在另一优选例中，所述组合物为口服制剂。

67、在另一优选例中，所述组合物(如药物组合物)通过以下方式施用于哺乳动物：口服、静脉注射、局部施用。

68、本发明第二方面提供了一种组合物，包括：

69、(a1)ras信号通路激动剂；

70、(a2)任选的，pten抑制剂

71、(b)药学上可接受的载体。

72、在另一优选例中，所述组合物还包括(a3)其他的促进神经轴突再生和神经元存活；和治疗中枢神经损伤疾病的药物。

73、在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

74、在另一优选例中，所述的组合物中，所述组分(a1)占所述组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。

75、在另一优选例中，所述的组合物中，所述组分(a2)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。

76、在另一优选例中，所述的组合物中，所述组分(a3)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。

77、在另一优选例中，所述组分(a1)和组分(a2)的重量比为1:100至100：1，较佳地为1:10至10：1。

78、在另一优选例中，所述组合物中可以是单一化合物，也可以是多个化合物的混合物。

79、在另一优选例中，所述的组合物用于制备(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病的药物或制剂。

80、在另一优选例中，所述的药物剂型为口服给药或非口服给药剂型。

81、在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。

82、在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂或针剂。

83、在另一优选例中，所述的组分(a1)和组分(a2)的总含量为组合物总重的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。

84、本发明第三方面提供了一种药盒，包括：

85、(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)ras信号通路激动剂，或含有活性成分(a)的药物；

86、(ii)任选的第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)pten抑制剂，或含有活性成分(b)的药物；和

87、(iii)说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)和活性成分(b)从而促进神经元再生的说明。

88、在另一优选例中，所述药盒还包括(iv)第三容器，以及装于该第三容器中的活性成分(c)促进神经轴突再生和神经元存活；和治疗中枢神经损伤疾病的药物，或含有活性成分(c)的药物。

89、在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器可以相同，可以不同。

90、在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含有ras信号通路激动剂的单方制剂。

91、在另一优选例中，所述的第三容器的药物是含有(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病药物的单方制剂。

92、在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

93、在另一优选例中，所述试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)和活性成分(b)从而促进神经轴突再生和神经元存活，及治疗中枢神经损伤疾病的说明。

94、本发明第四方面提供了一种促进神经元再生的方法，包括步骤：

95、在ras信号通路激动剂存在的条件下，培养神经元细胞，从而促进神经元的再生。

96、在另一优选例中，所述神经元细胞包括外周感觉神经细胞。

97、在另一优选例中，所述神经元细胞包括视网膜神经节细胞。

98、在另一优选例中，所述神经元细胞包括大脑皮层神经细胞

99、在另一优选例中，所述方法还包括ras信号通路激动剂与神经元细胞的接触。

100、在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。

101、在另一优选例中，所述神经元细胞为体外培养的细胞。

102、在另一优选例中，所述方法为治疗性的。

103、在另一优选例中，所述ras信号通路激动剂的作用浓度为1-80μm，较佳地，3-50μm，更佳地，5-20μm，更佳地，8-15μm。

104、本发明第五方面提供了一种筛选(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病的潜在治疗剂的方法，包括：

105、(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达ras的细胞一段时间t1，检测测试组所述培养体系中的ras的表达量e1；

106、并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中ras的表达量e2；和

107、(b)对e1和e2进行比较，如果e1显著高于e2，则表示所述测试化合物是(a)促进神经轴突再生和神经元存活；和(b)治疗中枢神经损伤疾病的潜在治疗剂。

108、在另一优选例中，所述“显著高于”指e1/e2≥2，较佳地，≥3，更佳地，≥4。

109、在另一优选例中，所述细胞为神经元细胞。

110、在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。

111、在另一优选例中，所述方法为体外的方法。

112、在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

113、在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的潜在治疗剂施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的神经轴突再生和神经元存活的影响。

114、在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

115、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物、灵长目动物，较佳地，包括小鼠、大鼠、兔、猴。

116、本发明第六方面提供了一种预防和/或治疗中枢神经损伤疾病的方法，包括步骤：

117、给需要的对象施用ras信号通路激动剂、本发明第二方面所述的组合物、或本发明第三方面所述的药盒。

118、在另一优选例中，所述的施用包括口服。

119、在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

120、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

121、在另一优选例中，所述ras信号通路激动剂的施用剂量为2周连续施加2-14次，较佳地，4-12次，更佳地，9-11次。

122、在另一优选例中，所述pten抑制剂的施用剂量为0.01-0.5mg/kg。

123、在另一优选例中，所述ras信号通路激动剂的施用频率为2-14次/2周，较佳地为4-12次/2周，更佳地，9-11次/2周。

124、在另一优选例中，所述pten抑制剂的施用频率为1-4次/2周，更佳地，1-2次/2周。

125、在另一优选例中，所述ras信号通路激动剂的施用时间为1-5周，更佳地，1-3周。

126、在另一优选例中，所述pten抑制剂的施用时间为1-4周，更佳地，1-2周。

127、在另一优选例中，所述的施用包括同时施用或先后施用。

128、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。