一种泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株及其应用

本发明属于基因工程与生物疫苗。更具体地，涉及一种泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株及其应用。

背景技术：

1、隐孢子虫(cryptosporidium spp.)是一种重要的人兽共患的消化道寄生原虫，宿主范围非常广泛，可感染包括人在内的多种哺乳类动物、禽类、反刍类、鸟类鱼类、爬行类和啮齿类等。隐孢子虫的感染可导致宿主急性腹泻、恶心、呕吐和体重减轻等症状，通常是自限性的，但免疫力低下的患者和幼龄动物症状较为严重，甚至可危及生命。隐孢子虫在发展中国家和工业化国家的传播率较高，是导致五岁以下儿童死亡的二号病原，目前也仅有唯一批准的治疗隐孢子虫病的药物硝唑尼特适用于免疫力正常的患者，而对免疫力低下或新生儿效果甚微，且尚未批准用于动物治疗，十分缺乏有效的治疗药物。

2、近几十年，隐孢子虫引起的隐孢子虫病在人类和养殖动物中出现过多次的暴发，造成重大的公共卫生事件和经济损失。因此，寻找隐孢子虫潜在的药物或疫苗靶点，开发有效药物和疫苗，对改善动物福利和生产性能尤为重要。而泰泽隐孢子虫(cryptosporidiumtyzzeri)作为最早被发现的隐孢子虫虫种，它的天然宿主就是小鼠，且泰泽隐孢子虫感染小鼠出现的病理特征与人类感染隐孢子虫出现的病理特征相似。由于常见的虫种如微小隐孢子虫和人隐孢子虫等无法感染免疫功能正常的小鼠，而使用泰泽隐孢子虫来感染免疫功能完全的小鼠，可以更好地研究隐孢子虫的致病机制以及进行药物和疫苗的筛选。但目前也缺乏能够有效防治泰泽隐孢子虫感染的药物或疫苗虫株。

3、gp40和gp15是隐孢子虫的两个重要的免疫显性抗原，现有研究显示，抗隐孢子虫的免疫血清可识别20多种子孢子表面抗原，其中就包括gp40和gp15。受限于特殊的生活史，隐孢子虫不能在体外连续培养，因此获得大量的天然虫体蛋白十分困难。通过gp15的原核表达及抗血清制备，获得的重组蛋白免疫小鼠血清能和泰泽隐孢子虫卵囊可溶性抗原特异性反应(宋悦,米荣升,赵权,等.泰泽隐孢子虫cp15基因的原核表达及抗血清制备[j].中国动物传染病学报,2017,25(02):66-71.)；而原核表达系统不具备糖基化等修饰功能，得到的重组蛋白功能不完全，目前缺乏能够有效防治泰泽隐孢子虫感染的药物或疫苗虫株。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有防治泰泽隐孢子虫感染的药物或疫苗虫株的不足，提供一种泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株及其应用。

2、本发明的目的是提供一种泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株。

3、本发明另一目的是提供泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株的制备方法。

4、本发明又一目的是提供泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株的应用。

5、本发明再一目的是提供一种防治泰泽隐孢子虫的药物。

6、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

7、本发明提供一种泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株，通过基因编辑技术将泰泽隐孢子虫ctgp40基因和/或ctgp15基因连接到弓形虫中进行表达，从而获得泰泽隐孢子虫基因编辑虫株；所述ctgp40基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，ctgp15基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

8、本发明通过基因编辑技术将泰泽隐孢子虫的ctgp40和ctgp15基因在弓形虫中进行异源表达，成功构建得到泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株；通过异源表达，在弓形虫中能表达并定位出ctgp40和ctgp15蛋白；进行动物免疫后，显示随着免疫后的天数增加，小鼠体内的igg抗体水平也在不断增长，并能明显减弱卵囊排泄强度，减小阳性小鼠数量，降低感染性，且采用该基因编辑虫株进行免疫后不会影响小鼠生长，通过弓形虫异源表达的tati虫株也没有表现出毒性，免疫后小鼠均未死亡，在感染泰泽隐孢子虫的过程中，发挥了一定的免疫保护作用，能够用于制备泰泽隐孢子虫疫苗虫株，防治泰泽隐孢子虫感染。

9、本发明提供泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株的构建方法，具体包含以下步骤：

10、s1.以puc19-pgra1-dhfr*质粒为模板，采用ctgp40和/或ctgp15同源重组质粒引物，构建ctgp40和/或ctgp15同源重组质粒；

11、s2.将crispr质粒与同源重组质粒共转染至弓形虫虫株中，通过药物筛选、pcr鉴定，获得的阳性单克隆虫株即为泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株。

12、优选地，步骤s1中ctgp40和/或ctgp15同源重组质粒引物序列依次如seq id no：3～8所示。

13、优选地，步骤s2中弓形虫虫株为tati虫株。

14、作为一种优选地实施方案，本发明提供更加具体的泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株的构建方法：

15、首先，以puc19-pgra1-dhfr*质粒为模板，构建ctgp40和ctgp15的同源重组质粒；然后使用crispr技术，将泰泽隐孢子虫的ctgp40和ctgp15基因分别插入到弓形虫tati虫株的uprt位点进行异源表达；通过药物筛选和pcr鉴定，得到能够稳定表达泰泽隐孢子虫ctgp40和ctgp15基因的弓形虫基因编辑虫株。

16、本发明提供泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株在制备防治泰泽隐孢子虫感染的药物中的应用。

17、本发明提供泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株在制备体外抑制泰泽隐孢子虫生长的产品中的应用。

18、本发明提供泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株在制备泰泽隐孢子虫疫苗中的应用。

19、本发明提供一种防治泰泽隐孢子虫感染的药物，含上述泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株。

20、优选地，药物的剂型为片剂、胶囊、口服液体制剂、喷雾剂或注射液。

21、本发明提供一种泰泽隐孢子虫疫苗，含上述泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株。

22、本发明具有以下有益效果：

23、本发明通过基因编辑技术将泰泽隐孢子虫的ctgp40和ctgp15基因在弓形虫中进行异源表达，成功构建得到泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株；通过异源表达，在弓形虫中能表达并定位出ctgp40和ctgp15蛋白；进行动物免疫后，显示随着免疫后的天数增加，小鼠体内的igg抗体水平也在不断增长，并能明显减弱卵囊排泄强度，减小阳性小鼠数量，降低感染性，且采用该基因编辑虫株进行免疫后不会影响小鼠生长，通过弓形虫异源表达的tati虫株也没有表现出毒性，免疫后小鼠均未死亡，在感染泰泽隐孢子虫的过程中，发挥了一定的免疫保护作用，能够用于制备泰泽隐孢子虫疫苗虫株，防治泰泽隐孢子虫感染。

技术特征：

1.一种泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株，其特征在于，通过基因编辑技术将泰泽隐孢子虫ctgp40基因和/或ctgp15基因连接到弓形虫中进行表达，从而获得泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株；所述ctgp40基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，ctgp15基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

2.权利要求1所述异源表达虫株的构建方法，其特征在于，具体包含以下步骤：

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤s1中ctgp40和/或ctgp15同源重组质粒引物序列依次如seq id no：3～8所示。

4.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤s2中弓形虫虫株为tati虫株。

5.权利要求1所述异源表达虫株在制备防治泰泽隐孢子虫感染的药物中的应用。

6.权利要求1所述异源表达虫株在制备体外抑制泰泽隐孢子虫生长的产品中的应用。

7.权利要求1所述异源表达虫株在制备泰泽隐孢子虫疫苗中的应用。

8.一种防治泰泽隐孢子虫感染的药物，其特征在于，含权利要求1所述异源表达虫株。

9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，药物的剂型为片剂、胶囊、口服液体制剂、喷雾剂或注射液。

10.一种泰泽隐孢子虫疫苗，其特征在于，含权利要求1所述异源表达虫株。

技术总结本发明公开了一种泰泽隐孢子虫基因的弓形虫异源表达虫株及其应用。本发明通过基因编辑技术将泰泽隐孢子虫的Ctgp40和Ctgp15基因在弓形虫中进行异源表达，成功构建得到泰泽隐孢子虫基因的弓形虫编辑虫株；通过异源表达，在弓形虫中能表达并定位出CtGP40和CtGP15蛋白；进行动物免疫后，显示随着免疫后的天数增加，小鼠体内的IgG抗体水平也在不断增长，卵囊排泄强度明显减弱，减小阳性小鼠数量，降低感染性，且在免疫后不会影响小鼠生长，免疫后小鼠均未死亡，在感染泰泽隐孢子虫的过程中，发挥了一定的免疫保护作用，能够用于制备泰泽隐孢子虫疫苗虫株，防治泰泽隐孢子虫感染。技术研发人员：肖立华,徐艳华,冯耀宇,郭亚琼,李娜,许瑞,夏宁波,元冬娟受保护的技术使用者：华南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/12