诱导转录单元、包含转录单元的表达载体及其应用

本技术属于生物，特别涉及用于酵母菌表达的转录单元和用该转录单元构建的真核表达载体。

背景技术：

1、可诱导基因表达系统(inducible gene expression system)允许转基因在特定的时间或特定的组织、细胞类型内调控基因的表达水平。可诱导基因表达系统作为一种常用且重要的工具，广泛应用于各种生物学研究和工业生产中，包括表达外源基因、对靶基因进行功能分析以及互补实验等。

2、在酵母表达系统中，目前有两类主要的诱导系统用于基因表达的调控。第一类诱导系统依赖于改变酵母代谢途径来激活不同类型的启动子，包括常见的半乳糖诱导启动子和甲醇诱导启动子(诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平)。半乳糖诱导的基因gal1-10启动子是酿酒酵母最常用的调控性启动子，它可以被半乳糖诱导，在培养中需要先进行棉子糖饥饿处理后半乳糖诱导。但这种诱导系统受到葡萄糖含量的抑制，而葡萄糖是正常培养基的碳源，更换培养基耗时耗力。甲醇营养型酵母诱导系统主要应用于毕赤酵母(pichia pastoris)蛋白表达系统，在酿酒酵母中的应用较少。

3、第二类诱导系统使用人工设计的载体，这些载体包括三个基本元件：

4、1.识别特定靶标结合位点的dna结合结构域，如gal4蛋白介导的结合、lexa(调节sos反应的阻遏蛋白)介导的结合、tet(四环素)阻遏蛋白介导的结合以及锌指结构域介导的结合。gal4具有两个结构域：位于n末端的dna结合结构域(bd)和位于c末端的转录激活结构域(ad)。dna结合结构域(bd)能识别基因启动子的上游激活序列(upstream activatingsequence，uas)，转录激活结构域(ad)可同转录复合物的其他成分作用，启动基因的转录。lexa系统中，dna结合结构域由一个完整的原核蛋白lexa构成，转录激活结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽b42构成，它在酵母中可以活化基因的转录。gal4和lexa蛋白目前被广泛用于酵母双杂交系统，因此需要考虑其他识别不同dna序列的结合蛋白来构建后续的诱导系统。

5、2.负责调节基因表达的小分子响应结构域，如铜离子结合结构域、四环素结合结构域和雌二醇结合结构域；tet-on(四环素)系统是一种利用原核调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系，其应用的范围广泛，与之配套的四环素分子稳定且诱导效率高，但是最新的研究发现，四环素的使用会损伤细胞中的线粒体，可能阻碍了其介导的诱导系统进一步推广；铜离子介导的诱导系统效率低下。锌指结构域多样性程度高，避免了诱导系统对宿主的影响，逐渐成为研究者的首选。

6、3.决定转录特征和活性的转录激活结构域。包括来自转录单元oct-1、oct-2a和sp1的富含谷氨酰胺的转录激活结构域，来自转录单元ctf/nfi和ap-2的富含脯氨酸的转录激活结构域，来自疱疹病毒vp16、gala、p65(nf-xb)和tfe3(转录单元结合ighm增强子3)的富含负电荷的转录激活结构域，以及来自itf-1和itf-2(肠三叶因子)的富含丝氨酸/苏氨酸的转录激活结构域等。

7、目前在酵母表达系统中，广泛使用的是vp16(疱疹病毒vp16蛋白)转录激活结构域，但其对游离的载体具有较高的激活背景，本技术的发明人发现发展表达高效且背景低的诱导转录单元是需解决的问题。

技术实现思路

1、通过文献检索已发表的具有转录激活功能的转录单元，将转录单元的转录激活结构域提取出来，放到pondr网站进行分析，结果如表1所示，具有转录激活功能的构建体往往含有内在无序区(idr)结构域，序列分析的结果提示在酵母中，idr结构域可能具有转录激活功能。

2、表1

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5、通过生物信息学的结构预测发现，转录活性可能依赖于转录激活结构域中固有无序蛋白(idps)或固有无序区域(idrs)。固有无序区域(idrs)指的是蛋白质中缺乏明确定义的三维结构的片段。与具有特定折叠结构的传统蛋白质结构域不同，idrs具有固有的灵活性和动态性。这些区域具有高度的无序性，缺乏稳定、有序的构象。尽管缺乏固定的结构，idrs在各种细胞过程中发挥着重要的作用，包括信号传导、调控和分子识别。idrs通常与多种蛋白相互作用，使其能够参与多样的生物学功能，如转录调节、细胞信号传导和蛋白质相互作用。

6、鉴于目前尚缺乏表达背景低，诱导速度快，目的蛋白表达量高，同时兼容多系统的酵母诱导表达转录单元。在此，本技术深入研究了固有无序区域(idrs)对诱导表达系统的相关性影响后，继而提出以下技术实现要素：。

7、本技术的第一目的，在于提供一种用于真核细胞诱导表达的转录单元，其包括seqid no:1所示的dna结合结构域、seq id no:2所示的人类雌激素受体的配体结合结构域和转录激活结构域，其中所述转录激活结构域包括具有相变能力的固有无序区域。

8、根据本技术中的一些实施方案，固有无序区域包括且不限于seq id no:3所示的核疏蛋白98和/或seq id no:4所示的fus蛋白和/或seq id no:5所示的taf15蛋白。

9、本技术的第二目的，在于提供一种用于酵母菌的真核表达载体。

10、根据本技术中的一些实施方案，真核表达载体包括本技术的第一目的中所提供的转录单元以及启动子、终止子、真核复制起始点、多克隆位点、原核复制起始点和抗生素抗性基因等表达元件。该启动子能与该诱导表达转录单元相结合，随后激活转录。

11、本技术的第三目的，在于提供包括以上诱导表达转录单元的酵母菌或包括具有该转录单元的真核表达载体的酵母菌，酵母菌包括且不限于毕赤酵母或酿酒酵母。

12、本技术的第四目的，提供包含以上转录单元的酵母菌或包含具有转录单元的真核表达载体的酵母菌在表达目的蛋白中的应用。

13、本技术的第五目的，在于提供一种诱导蛋白表达的方法。

14、根据本技术中的一些实施方案，诱导蛋白表达的方法包括制备和使用包含以上转录单元的酵母菌或包含具有转录单元的真核表达载体的酵母菌。

15、根据本技术中的一些实施方案，还需先将pcr扩增后的dna结合结构域片段、人类雌激素受体配体结合结构域片段和转录激活结构域片段连接到包含启动子、真核复制起始点、多克隆位点、原核复制起始点和抗生素抗性基因的真核表达载体中，构建重组诱导表达载体。然后，将重组诱导表达载体转化到酵母感受态细胞中。然后将酵母感受态细胞接种到适当的培养基中加入雌二醇诱导，30℃振荡扩大培养数小时后，收集菌液、离心去上清和收集菌体。

16、发明的有益效果

17、本技术提供的酵母诱导转录单元，分别融合表达三种具有不同相变能力的idr结构域，通过与vp16阳性对照比较后发现，三种酵母诱导转录单元中都展现的表达背景低和表达量高的双重优势。其中nup98诱导转录单元的表达背景最低和表达量最高。因此，尽管不同的idr结构域转录单元的转录活性有一定差异，但具有idr结构域转录单元的真核表达载体在酿酒酵母表达系统中均呈现出快速诱导动力学、精确的表达水平控制、极低的背景表达的绝对优势，并且此类酵母也不需要限定的生长培养基，对于目的蛋白表达的应用范围更大。