一种司美格鲁肽的制备方法与流程

本发明涉及多肽合成领域，具体涉及一种司美格鲁肽制备和纯化方法，尤其涉及粗肽析出方法。

背景技术：

1、司美格鲁肽(semaglutide)一款新型长效glp-1类似物，注射剂于2017年在美国上市。2019年，fda又批准口服司美格鲁肽上市，作为首款口服的glp-1类似物糖尿病药物。另外，该药物不但用于治疗ii型糖尿病，且由于具有出色的减重效果，于2022年6月份获得fda批准作为减肥药上市。因此，该药的市场前景被广泛看好，根据诺和诺德发布的2022年度财报，司美格鲁肽总销售额已将近120亿美元。

2、司美格鲁肽作为glp-1类似物，与人glp-1具有94％的序列同源性。化学名为n6.26-{18-[n-(17-carboxyheptadecanoyl)-l-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctadecanoyl}-[8-(2-amino-2-propanoicacid),34-l-arginine]humanglucagon-like peptide 1(7-37)，cas号为910463-68-2，分子式为c187h291n45o59，分子量为4113.58，肽序如下：

3、

4、目前报道关于索玛鲁肽的化学合成方法主要采用固相逐步偶联法(fmoc-spps)，如专利：cn103848910b，cn106478806a，cn108359006a，cn106928343a。固相逐步偶联法偶联过程中树脂的收缩较为严重，易产生缺失肽杂质。因此，全保护肽片段缩合法合成索玛鲁肽应运而生，如专利：cn106749613a，cn104356224a，cn108359006a，cn109456401a，cn109627317a，该策略的基本思路是：首先通过固相合成得到几个全保护的小片段多肽，再在液相中或固相载体上缩合得到全保护的长肽链，最后裂解侧链保护基得到索玛鲁肽。

5、然而无论是固相逐步偶联，还是全保护肽片段缩合法。在肽树脂裂解时，粗肽析出工艺基本都是采用裂解试剂对树脂进行切割，过滤，裂解液加入乙醚或叔丁基甲醚中沉淀得到粗肽。这类常规操作乙醚析出的沉淀不好，比较粘稠，过滤比较慢，只能通过杯式离心机或平板式离心机得到粗肽，离心过程不但会包裹杂质到粗品中，影响后一阶段的纯化以及产品质量。而且这种离心方式由于沉淀粘度大、颗粒细、两相比重差十分微小导致分离效果差，难以形成明显的分界线，导致离心效率低下，且容易因上清液浑浊造成倾倒损失。

6、目前，司美格鲁肽全球api需求量巨大，采用杯式离心机或平板式离心机无法满足大规模商业化生产，采用快速的袋式离心过滤方式可以提高粗肽沉淀过滤效率，满足大规模商业化生产。但袋式离心过滤需要裂解液粗肽沉淀得到的颗粒较大，不粘稠。正如专利cn112111002b所述传统方法将裂解液加入乙醚、异丙醚或叔丁基甲醚的方法，得到裂解液粗肽沉淀颗粒较细，导致很难过滤的问题。

7、目前发现司美格鲁肽的析出专利很少，仅有cn112111002b公布了一种裂解液粗肽沉淀方法，即在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，进行裂解液粗肽析出，然后过滤获得司美格鲁肽。本发明的方法采用了特殊的试剂组合进行粗肽析出，粗肽沉淀颗粒均匀，夹杂杂质少，能够通过过滤的方式进行分离。该专利优选了乙酸乙酯/环己烷体积比为1:1的混合溶剂，虽然更为环保，但使用该混合溶剂缺点有三：1)大量的乙酸乙酯在裂解液tfa作用下易产生乙酸，容易导致多肽序列中ser的羟基、n端氨基发生乙酰化副反应，从而导致产生api的乙酰化杂质，影响产品质量。尤其是ser8乙酰化杂质离api主峰很近，影响后续hplc纯化；2)乙酸乙酯相对于醚类溶剂，对于多肽的溶解性更好，导致颗粒性状仍过细，且过滤仍有部分粘稠，影响过滤效率。3)乙酸乙酯相对于醚类溶剂更难干燥，高温干燥容易导致粗肽降解，影响产品质量。

技术实现思路

1、司美格鲁肽由于api全球年需求量未来可能以吨计，采用常规沉淀方法，只能使用杯式离心方式或平板式离心机进行离心，这种离心方式由于沉淀粘度大、颗粒细、两相比重差十分微小导致分离效果差，难以形成明显的分界线，使得离心效率低下，也溶于因上清液浑浊造成部分损失，完全不适合大规模化生产。袋式离心已成为主流离心方式，袋式离心原理实质上是通过滤袋进行过滤分离，袋式离心能极大地提高生产效率。但粗肽的颗粒大小、性质影响离心效果。按常规沉降工艺，得到的粗肽沉降液均为牛奶状，容易透过滤袋或堵滤袋，导致无法进行袋式离心。

2、对此，本发明提出一种一种司美格鲁肽制备方法，具体包括司美格鲁肽的粗肽沉淀方法，仍基于常规使用的叔丁基甲基醚、乙醚或异丙醚为沉淀试剂。通过对裂解液降温，然后将预冷的醚类溶剂滴加至裂解液中，控制滴加温度，可极大地改善了粗肽沉淀的颗粒性状，使得即使使用500目的滤袋均极易过滤，过滤速度非常快，提高了生产效率，有利于大规模化商业生产。而且本发明由于沉淀效果较好，醚类试剂的用量与裂解液体积比由常规的1:8～1:12降为1:4，相对于现有技术例如专利cn112111002b沉淀试剂使用量1:10，极大的降低了醚类试剂的用量，既节约了成本，又减少废液排放，有利于环保。

3、本发明一种司美格鲁肽制备方法，包括如下步骤：1)固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽的肽树脂；2)肽树脂加入裂解试剂进行裂解，过滤获得裂解液；3)将裂解液降温至-20～10℃，在裂解液中缓慢加入预冷至-20～10℃醚类试剂，控制滴加时沉降液温度不超过15℃，进行析出；4)将析出沉淀过滤获得司美格鲁肽。

4、在本发明的实施方案中，步骤3)所述醚类溶剂为乙醚、异丙醚及叔丁基甲醚，或其中任意两种醚类试剂的混合物及三种试剂的混合物。

5、在本发明的实施方案中，步骤3)所述过滤后裂解液降温至-20～10℃，优选-10～0℃。

6、在本发明的实施方案中，步骤3)所述控制滴加时沉降液温度不超过15℃，优选温度不超过10℃，进一步优选温度不超过5℃。

7、在本发明的实施方案中，步骤3)所述醚类试剂用量与裂解液体积比为1:4～1:12，优选1:4～1:6，最优选1:4。

8、在本发明的实施方案中，步骤4)中过滤的方法为减压过滤或袋式离心过滤，优先袋式离心过滤。

9、在本发明的实施方案中，步骤4)中过滤采用的滤布为200目～3000目，优选200～1000目，最优选500目。

10、在本发明的实施方案中，步骤2)所述的裂解剂为tfa、tis、edt或dtt或dodt、phoh和h2o的混合，优选tfa：tis：edt＝90:5:5(体积比)；裂解时间为1.5～3.5小时。

11、在本发明的实施方案中，步骤1)中可以采用任意固相合成方法制备的司美格鲁肽肽树脂。例如，在固相合成树脂上从c端向n端依次合成主链，然后脱除lys的侧链保护基，并偶联侧链。合成主链和侧链的方法可以为依次偶联氨基酸或多个氨基酸形成的多肽片段。也可以采用先合成主链的一部分，然后延伸生成主链，然后再完成主链的方法。采用已知的任意方法制成的司美格鲁肽的肽树脂均可。

12、本发明采用乙醚、异丙醚或甲基叔丁基醚作为沉淀试剂，通过裂解液降温及控制滴加时沉降液温度，克服了专利cn112111002b所述传统方法很难过滤的问题。本发明醚类试剂的用量与裂解液体积比由1:8～1:12降为1:4，降低了生产成本。采用传统的乙醚、异丙醚或甲基叔丁基醚作为沉淀试剂，可以克服了专利cn112111002b使用乙酸乙酯溶剂导致乙酰化杂质问题，得到的粗肽纯度更高，后续纯化难度降低。相比乙酸乙酯，对多肽的溶解性更差，可以克服了专利cn112111002b使用乙酸乙酯溶剂导致的粗肽部分粘稠问题，过滤速度更快。且相比乙酸乙酯，沸点更低，更容易干燥。本发明还对相关的操作参数进行研究探索获得较优的操作方法，具有较明显的技术优势。