核酸释放剂、试剂盒及环介导等温核酸扩增方法与流程

本发明涉及核酸检测，具体涉及一种核酸释放剂、一种环介导等温核酸扩增体系、一种试剂盒及其用途，以及一种环介导等温核酸扩增方法。

背景技术：

1、等温扩增技术是20世纪90年代初期为解决pcr技术存在的不足而提出的核酸扩增技术。pcr技术虽然在灵敏度、特异性方面表现突出，但因变温循环过程的存在，不可避免地需要精密的温度控制设备，这限制了该技术在资源受限环境和即时诊断分析中的应用，而等温扩增技术就是在此背景下发展起来的。与pcr技术相比，等温扩增能够在特定的恒定温度下实现目标核酸序列的扩增，简化了反应中温度的变化过程，降低了对精密设备的需求，通过简单的水浴锅等其他加热模块即可完成反应。在过去的30年里，等温扩增技术在多种核酸分析领域迅速发展，在病原体检测、mirna检测、单核苷酸多态性、dna甲基化等核酸分析中得到了广泛应用。

2、近些年，新的等温核酸扩增技术层出不穷。其中较为成熟的等温扩增技术有环介导等温扩增技术(lamp)、重组酶聚合酶扩增技术(rpa)、滚环核酸扩增技术(rca)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(hda)、依赖于核酸序列的扩增技术(nasba)、链替代扩增技术(sda)等。这些技术或者基于dna/rna生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的核酸酶。这些技术设计简单，易于和其他信号方法技术或分析测试技术平台(如微流控)联用，在生物分析中展现出独特的优势。

3、环介导等温扩增(lamp)是一种在等温条件下仅通过一种聚合酶进行核酸快速扩增的方法。lamp根据目标序列的6-8个区域设计4-6条特异性引物，在等温(60-65℃)条件下用一种具有链置换活性的dna聚合酶来进行指数扩增，整个反应可以在1小时之内完成，产物可以通过肉眼观测，无需复杂的仪器，为生物分子的快速检测提供了一个较好平台。此外，该技术具有很好的特异性，不需要进行模板的热变性和温度循环步骤、反应简单快速，因此受到研究者的广泛关注，并被成功用于众多分析物的检测。

4、但是，需要1小时才能完成核酸扩增的环介导等温扩增技术，已经不能满足快速核酸检测的需求。因此，需要提高扩增效率以满足当前对快速核酸检测和快速诊断的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种核酸释放剂、一种环介导等温核酸扩增体系、一种试剂盒及其用途，以及一种环介导等温核酸扩增方法，旨在通过提供新的核酸释放试剂和/或环介导等温核酸扩增体系，从而显著提高扩增效率。

2、为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种核酸释放剂，其包括十二烷基硫酸钠(sds)、硫酸铵、莎梵婷(surfactin)、氯化钾、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tecp)、乙基苯基聚乙二醇(np-40)、triton-x 100和水。

3、本发明第二方面，提供了一种环介导等温核酸扩增体系，其包括硫酸镁、dntp、bstdna聚合酶、比色剂、硫酸铵、碱金属盐、碱金属氢氧化物、吐温20(tween 20)和引物。

4、本发明第三方面，提供了一种试剂盒，其包括本发明提供的所述核酸释放剂，和/或本发明提供的所述环介导等温核酸扩增体系。

5、本发明第四方面，提供了所述核酸释放剂、所述环介导等温核酸扩增体系、所述试剂盒在核酸扩增和/或核酸检测中的用途。

6、本发明第五方面，提供了一种环介导等温核酸扩增方法，其包括如下步骤：

7、提供本发明提供的所述核酸释放剂、所述环介导等温核酸扩增体系以及待测样本；

8、将所述待测样本与所述核酸释放剂进行混合反应，得到反应液；

9、将所述反应液与所述环介导等温核酸扩增体系进行环介导等温核酸扩增反应，得到扩增产物。

10、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

11、1)本发明提供了特定组分的、无缓冲液的核酸释放剂，可以在5分钟内实现待测样本的快速核酸释放，并且无需其他核酸的纯化分离步骤，可直接加入到后续的核酸扩增体系中用于核酸检测。同时，本发明还提供了特定组分的、无tris-hcl缓冲液的环介导等温核酸扩增体系，便于扩增过程中溶液ph值在较大范围内快速变化，从而提高扩增效率、缩短扩增时间。

12、2)本发明提供的环介导等温核酸扩增方法通过使用所述核酸释放剂和所述环介导等温核酸扩增体系，使核酸提取、扩增全过程在25分钟内即可完成，具有检测时间更短、效率更高的优点，能够适应更多的应用场景，满足分子poct快速诊断的需求。

技术特征：

1.一种核酸释放剂，其特征在于，包括十二烷基硫酸钠、硫酸铵、莎梵婷、氯化钾、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、乙基苯基聚乙二醇、triton-x100和水。

2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂中，除水之外各组分的浓度为：十二烷基硫酸钠2-20mm、硫酸铵5-50mm、莎梵婷0.01-2mm、氯化钾10-150mm、三(2-羧乙基)膦盐酸盐0.5～5mm、乙基苯基聚乙二醇0.1-1wt％和triton-x1000.05-0.5wt％。

3.一种环介导等温核酸扩增体系，其特征在于，包括硫酸镁、dntp、bst dna聚合酶、比色剂、硫酸铵、碱金属盐、碱金属氢氧化物、吐温20和引物。

4.根据权利要求3所述的环介导等温核酸扩增体系，其特征在于，所述环介导等温核酸扩增体系中，各组分的浓度为：硫酸镁6-10mm、dntp0.5-2mm、bstdna聚合酶0.16～1.28u/μl、比色剂0.05-0.2mm、硫酸铵6-30mm、碱金属盐10-50mm、碱金属氢氧化物6-30mm、吐温200.05-0.5wt％和引物2.6-10.4μm。

5.根据权利要求4所述的环介导等温核酸扩增体系，其特征在于，所述比色剂选自苯酚红、甲酚红、铬黑t、中性红、溴麝香草酚蓝、靛蓝、阿利新蓝、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、天青ii中的至少一种；

6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸释放剂，和/或权利要求3-5任一项所述的环介导等温核酸扩增体系；

7.权利要求1或2所述的核酸释放剂、权利要求3-5任一项所述的环介导等温核酸扩增体系、权利要求6所述的试剂盒在核酸扩增和/或核酸检测中的用途。

8.一种环介导等温核酸扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的环介导等温核酸扩增方法，其特征在于，所述混合反应的时间为5min；所述环介导等温核酸扩增反应的时间为10-20min。

10.根据权利要求8或9所述的环介导等温核酸扩增方法，其特征在于，将所述待测样本与所述核酸释放剂进行混合反应的步骤中，所述待测样本与所述核酸释放剂的体积比1:(1～10)，优选1:1。

技术总结本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种核酸释放剂、试剂盒及环介导等温核酸扩增方法。本发明通过提供无缓冲液的核酸释放剂以及无Tris‑HCl缓冲液的环介导等温核酸扩增体系，可以使核酸提取、扩增全过程在25分钟内即可完成，具有检测时间更短、效率更高的优点，能够适应更多的应用场景，满足分子POCT快速诊断的需求。技术研发人员：曹利勤,段年丰,魏巧龙,刘军鹏受保护的技术使用者：湖南先赛生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10