一种雨生红球藻CRISPR/Cas9基因编辑方法与流程

本发明属于分子生物学基因组编辑领域，具体涉及一种雨生红球藻crispr/cas9基因编辑方法。

背景技术：

1、虾青素是一种红色酮基类胡萝卜素，具有强抗氧化和抗衰老等能力，能有效中和自由基并清除活性氧，被广泛应用于饲料、化妆品、保健品、食品和医疗等领域。尽管虾青素可以通过化学合成低成本生产，但是由于安全问题，人们往往优先选择生物来源的虾青素。在自然界中，单细胞绿色微藻雨生红球藻的虾青素含量(占干重的4％)位列最高水平。因此，雨生红球藻既可用于商业生产虾青素，也可作为模式生物，研究虾青素的生物合成途径。然而，在工业生产中，雨生红球藻的养殖方法主要依赖自然生长，生长周期较长，虾青素含量不稳定，且易受外界环境因素影响。为提高雨生红球藻生物量及虾青素含量，对其进行定向改造至关重要，通常需实现单个或多个基因的敲除或敲入。因此，通过crispr/cas9基因编辑技术对雨生红球藻进行改造，缩短生长周期，提高虾青素的产量，具有重要的商业价值和科学意义。

2、成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr)系统，由cas9蛋白和单链向导rna(sgrna)组成，sgrna识别靶基因的特异性的20-22bp核苷酸序列，并与cas9蛋白结合，将其引导到靶dna序列进行切割，产生平末端双链断裂位点(dsb)。通过易错非同源重组的末端链接(nhej)产生的随机缺失或插入，可导致基因非精确敲除；或者通过基于外源dna修复模版的同源重组(dhr)或微同源重组(mmej)修复系统，可以实现基因的精准编辑，包括敲除、敲入、氨基酸替换或片段删除等。在雨生红球藻中建立高效的crispr/cas9系统有两个重要因素：(1)cas9和sgrna的高效表达策略(2)合适的转化方法。

3、crispr/cas9的表达策略目前有两种，crispr/cas9表达载体驱动和预组装cas9rnp复合物。jiang(2014年)采用crispr/cas9表达载体驱动的策略在莱茵衣藻中敲入和敲除四个靶基因，证明crispr/cas9在衣藻中是有功能的，然而由于cas9的毒性，作者未能获得任何稳定遗传的转化子。随后nymark(2016年)使用相同的策略改造了海洋硅藻三角褐指藻，靶向cpsrp54基因，与野生型藻株相比，cpsrp54突变体的生长速率降低。为了避免细胞毒性和脱靶事件，baek(2018年)成功使用预组装cas9 rnp复合物的策略敲除了莱茵衣藻玉米黄质环氧酶基因，最终获得了理想的δzep突变体，其玉米黄质产量比wt提高了47倍。chen(2023年)将预组装cas9 rnp复合物通过电转化的方法转入莱茵衣藻中，通过采用不同的供体dna实现基因的敲除、敲入、氨基酸替换和片段删除。目前crispr/cas9系统仅在几种模式微藻中建立，比如：莱茵衣藻、三角褐指藻、海洋微拟球藻等，但是都是通过电转化的方法转入rnp复合物，国内外还没有关于雨生红球藻crispr/cas9通过基因枪方法转入rnp复合物的基因编辑技术的任何文献报道。

4、基因编辑成功的关键是外源遗传物质的高效转入，细胞壁被认为是将大分子引入植物细胞的最重要屏障，由于雨生红球藻具有坚硬厚实的细胞壁和透明胶状胞外基质，因此需要建立有效的转化方法将遗传物质转到细胞中。目前微藻常用的转化方法有玻璃珠法、电转化、农杆菌介导法、及基因枪法。玻璃珠法仅适用于细胞壁缺陷的藻株或制备原生质体，如细胞壁缺陷的莱茵衣藻或没有纤维质细胞壁的杜氏盐藻等。电转化方法仅适用于细胞壁薄的微藻，比如莱茵衣藻或微绿球藻等，卢水秀(2010年)报道了雨生红球藻的电转化方法，但并未获得稳定的转化子。kathiresan等人成功将包含gus、gfp和hpt的双元载体通过农杆菌介导转入雨生红球藻(2009年)，随后又将β-胡萝卜素酮化酶(bkt)基因通过此方法转入雨生红球藻(2015年)，但是此方法并不能被revital(2015年)成功重复。steinbrenner和sandmann(2006年)利用基因枪法成功将定点突变后的八氢番茄红素脱氢酶(pds)基因导入雨生红球藻。revital(2015年)分别尝试了电转化、农杆菌介导法和基因枪法，只有测试steinbrenner和sandmann(2006年)描述的基因枪方法获得成功，他们优化改造了八氢番茄红素脱氢酶(pds)基因，并将其通过基因枪法转化雨生红球藻，研究显示其转化效率明显优于之前报道的。guanhua yuan(2019年)构建含有基于雨生红球藻内源性tubulin启动子和终止子的壮观霉素抗性基因(aada)的表达质粒，并成功将其通过基因枪的方式转入雨生红球藻。因此，目前主要通过基因枪法转化雨生红球藻，但是仅局限于抗性基因质粒的遗传转化，较少涉及其他功能基因的转化，更未见基于crispr/cas9 rnp的雨生红球藻转化方法。然而，基因枪转化时处理rnp的方法不能简单套用处理质粒的方法，因为处理质粒需要用到的氯化钙和无水乙醇会导致rnp中cas9蛋白变性失活，产生沉淀。

5、综上所述，目前雨生红球藻的遗传操作体系仅限于通过基因枪的方法转入抗性基因，而未有转入rnp复合物实现基因编辑的报道，并且不能简单套用处理质粒的方法。其他微藻有转入rnp复合物的成功的案例，但是都是通过电转化的方法实现的，未见通过基因枪方法转入rnp复合物的报道。因此，一种基于基因枪转入rnp复合物的雨生红球藻crispr/cas9基因编辑方法亟待提出。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种雨生红球藻crispr/cas9基因编辑方法，该方法通过基因枪转化方法采用预组装cas9 rnp复合物策略，与供体dna和抗性质粒共转入雨生红球藻，并在恢复期加入抗生素培养10天后涂板，可以实现基因的敲除和敲入。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

3、本发明第一目的提供一种雨生红球藻crispr/cas9基因编辑方法，步骤如下：

4、(1)转化前准备：包括ca9蛋白的纯化、sgrna的设计和体外转录、体外剪切、抗性质粒的制备、供体dna的制备；

5、(2)基因枪转化：rnp的组装、用于转化藻细胞的制备；

6、(3)转化后恢复：添加抗生素培养；

7、(4)预筛选：通过荧光定量pcr和巢式pcr在细胞群里水平上预筛选；

8、(5)涂板和阳性克隆的筛选。

9、优选的，所述步骤(1)中cas9蛋白为来自化脓性链球菌spcas9，为了防止10％甘油导致cas9蛋白粘附在载体膜上，无法转入细胞中，我们透析使用的cas9储存缓冲液中的甘油含量为0-3％。

10、优选的，所述步骤(1)中抗性质粒的制备，具体包括：基于雨生红球藻内源性tubulin启动子和终止子的壮观霉素抗性基因(aada)，构建到pbluscript ii sk(+)上。

11、优选的，所述步骤(1)中供体dna的制备，使用包含3个终止子的供体dna，其中3个终止子在不同的阅读框里，使之不管如何移码都能终止，同时两端带上剪切位点上下游24bp的微同源臂。

12、优选的，所述步骤(2)中rnp的组装，具体包括：将cas9蛋白与针对目的基因的sgrna进行混合，于室温孵育，组装成cas9/sgrna rnp复合物。

13、优选的，所述步骤(2)中基因枪转化，具体包括：收集藻细胞到tap平板，吹干备用；将孵育好的rnp复合物、供体dna、抗性质粒和金粉混合均匀，滴到载体膜中央，自然吹干后进行基因枪转化(1350psi，6cm或9cm)。基因枪转化rnp和转化质粒是有区别的，基因枪转化质粒时，质粒和金粉混合后需要用到亚精胺碱、氯化钙和无水乙醇，但是氯化钙会使cas9蛋白沉淀，无水乙醇会使cas9蛋白变性，所以转化rnp时，使用直接混合后风干的策略。

14、优选的，所述步骤(3)中转化后恢复，具体包括：转化完将平板中间的细胞刮到bya培养基弱光静置恢复后，加入抗生素培养10天，离心收集藻细胞，用bya洗一遍后，涂在抗性平板上生长。其中，抗生素根据使用的抗性质粒去匹配对应的抗生素，不限于壮观霉素。

15、优选的，所述步骤(4)中荧光定量pcr和巢式pcr的预筛选，用于在细胞群体水平上检测实验组中是否有编辑事件的发生，从而对应到相应的平板，后期在有编辑事件发生的平板上进行单克隆筛选。

16、优选的，所述步骤(5)中涂板的细胞数为3-6*105个细胞/平板，阳性克隆的筛选鉴定采用pcr和测序筛选阳性克隆。

17、本发明第二目的提供一种雨生红球藻crispr/cas9基因编辑方法的应用，将所述雨生红球藻crispr/cas9基因编辑方法适用于与雨生红球藻细胞直径或细胞壁组成相似的藻类中应用。

18、本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：

19、1、本发明采用预组装cas9 rnp复合物的策略操作简单，无需克隆，能进行体外剪切，预测试cas9蛋白活性以及评估靶位点的剪切效率，还可以降低脱靶效应，并解决由于crispr/cas9表达载体持续表达cas9所导致的毒性问题。

20、2、本发明加入抗性基因培养10天，可以杀死部分野生型藻株，有效提高筛选效率。

21、3、本发明建立荧光定量pcr筛选方法，可以用于优化方法，使用的模板为粗提的基因组dna，可以节约精提基因组dna和跑胶检测的时间成本。

22、4、鉴于目前没有任何关于雨生红球藻crispr/cas9基因编辑技术的文献报道，本发明属于开创性工作。本发明能够实现基因组特定位点的基因敲除和插入等目的，为雨生红球藻的基因工程改造提供了技术支撑。同时，该方法对其他物种(尤其是细胞直径和细胞壁组成相似的物种)的基因编辑具有借鉴意义。