用于扩增淋巴细胞的组合物和方法与流程

本公开涉及细胞培养应用，并且更具体地说，涉及使用造血细胞的细胞培养应用，并且又更具体地说，涉及利用一种或多种淋巴细胞群体的细胞培养应用。

背景技术：

1、哺乳动物的血液由各种细胞类型组成，包括淋巴细胞、凝血细胞、红细胞以及它们的直接和间接前体。淋巴细胞可称为白细胞，并且这些细胞在宿主的免疫系统中发挥功能。淋巴细胞可进一步再分成b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。

2、与其他血细胞一样，淋巴细胞来源于能够自我更新和分化为每种血细胞谱系的造血干细胞(hsc)。t细胞是适应性免疫的核心组成部分，nk细胞在先天免疫中发挥重要作用，而b细胞是体液免疫的核心组成部分，在结合抗原后分泌抗体。

3、鉴于淋巴细胞参与感测其环境中的抗原，并且在刺激后引发免疫反应，它们是引起浓厚研究和治疗兴趣的主题。特定的b细胞、nk细胞或t细胞克隆可能特别令人感兴趣，因为它们具有检测特定抗原或引发反应的能力，但从血液样本中存在的细胞背景中分离这些细胞极其困难。工程改造b细胞、nk细胞或t细胞以执行特定功能是解决分离问题的一种相对较新的方法。

4、即使克服了获得单个特定淋巴细胞克隆的难题，仍会出现将这种细胞扩增到有意义的数量的独立问题。由于以单细胞形式或以克隆密度平板接种的淋巴细胞不易于在体外或离体扩增到足够多的数量，故需要用于克隆扩增单个淋巴细胞(例如b细胞、nk细胞或t细胞)的试剂和方法。

技术实现思路

1、本公开涉及用于扩增哺乳动物淋巴细胞(例如b细胞、nk细胞或t细胞)或其祖细胞的补充剂、培养基和方法。

2、本公开的一个方面提供了用于扩增哺乳动物淋巴细胞(例如b细胞、nk细胞或t细胞)或其祖细胞的细胞培养基补充剂。本公开的补充剂可以包含以下中的一者或多者：cd40的配体、脂质混合物、一种或多种细胞因子以及稀释剂。在一个实施方案中，本公开的补充剂可以包含以下中的两者或更多者：cd40的配体、脂质混合物和一种或多种细胞因子。

3、在一个实施方案中，稀释剂是水性的。在一个实施方案中，稀释剂是缓冲液。

4、在一个实施方案中，本公开的补充剂还可以包含第一类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，本公开的补充剂还可以包含第二类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，本公开的补充剂还可以包含第三类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，所述细胞外基质蛋白中的任一者或全部是重组的。在一个实施方案中，所述细胞外基质蛋白中的任一者或全部都溶解于稀释剂中。

5、在一个实施方案中，细胞外基质蛋白选自由以下组成的组：胶原蛋白、ecm1、e-钙粘蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白或sparc。在包含多种类型的细胞外基质蛋白的实施方案中，每种类型都是不同的。

6、在一个实施方案中，第一类型的细胞外基质蛋白、第二类型的细胞外基质蛋白(如果存在)或第三类型的细胞外基质蛋白(如果存在)的浓度范围在约1μg/ml至1mg/ml之间。

7、在一个实施方案中，cd40的配体是人或小鼠cd40的配体。在一个实施方案中，cd40的配体包含一种或多种蛋白质。

8、在一个实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自il-2、il-4、il-6、il-10和il-21。在一个实施方案中，前述细胞因子各自包含在补充剂中。在一个实施方案中，补充剂中包含il-2和il-10，以及任选的il-21。

9、在一个实施方案中，脂质混合物是化学成分确定的。在一个实施方案中，脂质混合物不含动物成分。在一个实施方案中，脂质混合物被稳定化。

10、在一个实施方案中，将补充剂与基础培养基组合。

11、在一个实施方案中，补充剂不含动物成分和/或不含血清。

12、在一个实施方案中，淋巴细胞(例如t细胞、nk细胞或b细胞)或其祖细胞是以单细胞形式或以克隆密度接种。

13、在一个实施方案中，补充剂是浓缩的。在一个实施方案中，补充剂是10x或更高浓度。

14、本公开的另一个方面提供了用于扩增哺乳动物淋巴细胞(例如t细胞、nk细胞或b细胞)或其祖细胞的培养基。本公开的培养基可以包含基础培养基以及以下中的一者或多者：cd40的配体、脂质混合物和一种或多种细胞因子。因此，在另一方面，基础培养基和一种或多种补充剂可包含在试剂盒中。在一个实施方案中，培养基不接触表面结合的或固定的细胞外基质蛋白。

15、在一个实施方案中，本公开的培养基还可以包含以下中的两者或更多者：cd40的配体、脂质混合物和一种或多种细胞因子。

16、在一个实施方案中，本公开的培养基还可以包含第一类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，本公开的培养基还可以包含第二类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，本公开的培养基还可以包含第三类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞外基质蛋白是重组的。

17、在一个实施方案中，细胞外基质蛋白选自由以下组成的组：胶原蛋白、ecm1、e-钙粘蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白或sparc。在包含多种类型的细胞外基质蛋白的实施方案中，每种类型都是不同的。

18、在一个实施方案中，第一类型的细胞外基质蛋白、第二类型的细胞外基质蛋白(如果存在)或第三类型的细胞外基质蛋白(如果存在)的浓度范围在约1μg/ml至1mg/ml之间。

19、在一个实施方案中，本公开的培养基还可以包含一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自il-2、il-4、il-6、il-10和il-21。在一个实施方案中，前述细胞因子各自包含在补充剂中。在一个实施方案中，补充剂中包含il-2和il-10，以及任选的il-21。

20、在一个实施方案中，cd40的配体是人或小鼠cd40的配体。在一个实施方案中，cd40的配体包含一种或多种蛋白质。

21、在一个实施方案中，脂质混合物是化学成分确定的。在一个实施方案中，脂质混合物不含动物成分。在一个实施方案中，脂质混合物被稳定化。

22、在一个实施方案中，淋巴细胞(例如t细胞、nk细胞或b细胞)或其祖细胞是以单细胞形式或以克隆密度接种。

23、在一个实施方案中，培养基支持淋巴细胞及其祖细胞的无饲养层扩增。

24、在一个实施方案中，培养基支持淋巴细胞及其祖细胞的无动物成分扩增。在一个实施方案中，所述培养基是无血清的。

25、本公开的另一个方面提供了扩增哺乳动物淋巴细胞(例如t细胞、nk细胞或b细胞)或其祖细胞的方法。在一个实施方案中，哺乳动物淋巴细胞或其祖细胞可以单细胞形式或以克隆密度进行平板接种。在一个实施方案中，哺乳动物淋巴细胞或其祖细胞不是以单细胞形式或以克隆密度进行平板接种。

26、所述方法可以包括将淋巴细胞或其祖细胞接种到培养环境中，并在所述培养环境中孵育/培养接种的细胞或其祖细胞超过一天，所述培养环境包含以下中的一者或多者：cd40的配体、脂质混合物和一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，孵育/培养细胞可以包括扩增细胞。在一个实施方案中，细胞还可以在培养/孵育步骤期间分化和/或活化。

27、在一个实施方案中，本公开的方法还可以在培养环境中包括第一类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，本公开的方法还可以在培养环境中包括第二类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，本公开的方法还可以在培养环境中包括第三类型的细胞外基质蛋白。

28、在一个实施方案中，第一类型的细胞外基质蛋白和/或第二类型的细胞外基质蛋白(如果存在)和/或第三类型的细胞外基质蛋白(如果存在)被包含在培养基中。

29、在一个实施方案中，细胞外基质蛋白选自由以下组成的组：胶原蛋白、ecm1、e-钙粘蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白或sparc。在包含多种类型的细胞外基质蛋白的实施方案中，每种类型都是不同的。

30、在一个实施方案中，第一类型的细胞外基质蛋白、第二类型的细胞外基质蛋白(如果存在)或第三类型的细胞外基质蛋白(如果存在)的浓度范围在约1μg/ml至1mg/ml之间。

31、在一个实施方案中，本公开的培养基还可以包含一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自il-2、il-4、il-6、il-10和il-21。在一个实施方案中，前述细胞因子各自包含在补充剂中。在一个实施方案中，补充剂中包含il-2和il-10，以及任选的il-21。

32、在一个实施方案中，cd40的配体是人或小鼠cd40的配体。在一个实施方案中，cd40的配体包含一种或多种蛋白质。

33、在一个实施方案中，脂质混合物是化学成分确定的。在一个实施方案中，脂质混合物不含动物成分。在一个实施方案中，脂质混合物被稳定化。

34、在一个实施方案中，接种和孵育步骤是在无饲养层条件下进行的。在一个实施方案中，接种和孵育步骤是在无血清条件下进行的。在一个实施方案中，接种和孵育步骤是在无动物成分条件下进行的。在一个实施方案中，接种和孵育步骤是在上述每个条件下进行的。

35、在一个实施方案中，淋巴细胞或其祖细胞是人或小鼠的。

36、在一个实施方案中，淋巴细胞是人或小鼠b细胞，并且所述b细胞是记忆b细胞或浆母细胞。

37、在一个实施方案中，本公开的方法还可以包括在培养环境中分化淋巴细胞或其祖细胞。在一个实施方案中，本公开的方法还可以包括在培养环境中活化和/或分化淋巴细胞或其祖细胞。

38、在一个实施方案中，孵育步骤持续至少3天。

39、根据以下详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。