一种银胶菊素C2羟化酶及其编码基因、制备方法与应用

本发明涉及生物，具体涉及一种银胶菊素c2羟化酶及其编码基因、制备方法与应用。

背景技术：

1、苍耳素系倍半萜内酯类化合物，主要合成于菊科植物苍耳中。苍耳素对肺癌以及肝癌等肿瘤细胞具有较强的抑制功效，其作用机制研究显示，苍耳素主要通过激活perk-eif2α-atf4等信号通路诱导了肿瘤细胞的凋亡。此外，在农业上苍耳素有望被开发成新型的植物源杀菌剂，比如由甘肃农业大学开发的30％苍耳素乳油对于番茄灰霉病菌和黄瓜黑星病菌有较强的抑菌活性，田间用药后14天其防治效果均达到了60％以上。

2、目前，苍耳素的来源主要是从苍耳植物中进行提取与纯化，然而由于野生苍耳植物资源较为有限，限制了其规模化开发与利用，另一方面尽管有关苍耳植物组织培养与植株再生体系研究已取得了一定的进展，然而由于苍耳素在苍耳植物中的含量仅有万分之几，其提取成本十分昂贵。

3、因此，亟需一种合成苍耳素的新途径。

技术实现思路

1、为了解决苍耳素来源所存在的上述问题，本发明提供一种银胶菊素c2羟化酶及其编码基因、制备方法与应用，为苍耳素的合成提供新途径。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种银胶菊素c2羟化酶，具有该银胶菊素c2羟化酶活性的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

4、a)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质；

5、b)在seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

6、c)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质；

7、d)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

8、优选地，所述标签为6×组氨酸标签、flag标签、mbp标签、ha标签或c-myc标签。

9、本发明的第二方面，提供编码上述的具银胶菊素c2羟化酶活性蛋白的基因，其核酸分子为如下(a)或(b)或(c)的基因：

10、(a)其编码序列是seq id no：1所示的cdna分子或基因组dna分子；

11、(b)与(a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码seq id no：2所示的蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；

12、(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸杂交，且编码seq id no：2所示的蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。

13、优选地，所述严格条件是在6×ssc(含0.5％ sds)的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×ssc(含0.1％ sds)和1×ssc(含0.1％ sds)各洗膜一次。

14、优选地，所述基因来源于苍耳。

15、本发明的第三方面提供一种表达盒，其含有上述编码具银胶菊素c2羟化酶活性蛋白的基因的核酸分子。

16、本发明的第四方面还提供一种表达载体，该表达载体含上述编码具银胶菊素c2羟化酶活性的基因的核酸分子。

17、优选地，所述表达载体是酵母表达载体或大肠杆菌表达载体。

18、本发明的第五方面，还提供一种转化细胞，该转化细胞含有上述编码具银胶菊素c2羟化酶活性的基因的核酸分子。

19、优选地，所述转化细胞为细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或者植物细胞。

20、本发明的第六方面，还提供所述的具银胶菊素c2羟化酶活性的蛋白质的制备方法，其至少包括如下步骤：

21、(1)扩增所述的编码具银胶菊素c2羟化酶活性的基因片段；

22、(2)将所述基因片段克隆至酵母表达载体得到酵母表达质粒；

23、(3)将所述酵母表达质粒转入毕赤酵母或酿酒酵母得到表达银胶菊素c2羟化酶的菌株，并诱导表达银胶菊素c2羟化酶。

24、本发明的第七方面，还提供所述具银胶菊素c2羟化酶活性的蛋白质在如下任一中的应用：

25、(a1)制备用于含2-羟基银胶菊素的产品；

26、(a2)制备用于含苍耳素的产品；

27、(a3)制备含银胶菊素c2羟化酶的产品。

28、本发明还提供一种苍耳素的合成方法，包括如下步骤：

29、(b1)以编码上述的具银胶菊素c2羟化酶活性蛋白的基因为目的基因，构建酵母表达系统；

30、(b2)利用酵母表达系统制备含银胶菊素c2羟化酶活性蛋白的酵母微粒体；

31、(b3)以银胶菊素为底物，利用酵母微粒体形成2-羟基银胶菊素；

32、(b4)2-羟基银胶素经酸化处理形成苍耳素。

33、本发明具有如下优点：

34、本发明首次从苍耳植物克隆到一个银胶菊素c2羟化酶基因的全长序列，并利用生物化学技术鉴定了该银胶菊素c2羟化酶能够利用银胶菊素为底物，在其c2位置进行羟基化形成2-羟基银胶菊素；2-羟基银胶素经酸化处理脱水即可形成苍耳素；因此，本发明为利用酶法合成苍耳素提供了一个关键的基因资源。

35、鉴于直接从植物中进行提取纯化苍耳素的生产成本高，环境污染大等缺陷，本发明基因的发现为代谢工程技术生产化合物苍耳素或2-羟基银胶菊素提供必要的基因资源，具有潜在的应用价值。

技术特征：

1.一种银胶菊素c2羟化酶，其特征在于，具有该银胶菊素c2羟化酶活性的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

2.编码具有如权利要求1所述的银胶菊素c2羟化酶活性蛋白的基因，其特征在于，其核酸分子为如下(a)或(b)或(c)的基因：

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因来源于苍耳。

4.一种表达盒，其特征在于，其含有如权利要求2所述的基因的核酸分子。

5.一种表达载体，其特征在于，其含有如权利要求2所述的基因的核酸分子。

6.一种转化细胞，其特征在于，其含有如权利要求2所述的基因的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的一种转化细胞，其特征在于，所述转化细胞为细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或者植物细胞。

8.如权利要求1所述银胶菊素c2羟化酶的制备方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

9.如权利要求1所述银胶菊素c2羟化酶的应用，其特征在于，用于

10.一种苍耳素的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结本发明涉及生物技术领域，公开一种银胶菊素C2羟化酶及其编码基因、制备方法与应用。该具银胶菊素C2羟化酶活性的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)中的任一种：a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质；d)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。本发明提供的银胶菊素C2羟化酶可在银胶菊素的C2位置催化羟基化反应，形成2‑羟基银胶菊素，生成的2‑羟基银胶菊素经过酸化处理形成苍耳素，为利用酶法生产苍耳素提供了关键的基因资源。技术研发人员：章焰生,李长福,卢凤柳受保护的技术使用者：上海大学技术研发日：技术公布日：2024/10/17