一种响应盐胁迫的人工启动子、报告系统和提高植物耐盐能力的方法

本发明属于基因工程领域，涉及植物盐胁迫的监测和提高植物耐盐能力的方法。

背景技术：

1、近年来，全球土壤盐渍化日益加剧，诸多国家和地区的粮食作物等遭受土壤盐渍化带来的盐胁迫的威胁，导致农作物减产或质量降低。盐胁迫指的是土壤中可溶性盐含量大量增加对植物的生长发育造成多层次多方面的危害，例如抑制植物种子的萌发和成苗的建立、减少根系水分和营养物质的吸收、降低光合作用等，最终严重影响植物的生长和发育。随着工业化进程的逐步加快以及不合理的灌溉方式，我国的耕地面积不断减少同时盐碱地面积不断增加，因而盐碱地治理以及培育抗盐作物新品种迫在眉睫。传统的治理方式会耗费大量的人力和物力，且效果不理想。近些年，随着分子生物学的发展和基因工程应用技术的日益更新，挖掘植物本身抗盐基因并通过基因改造，进而提高作物的耐盐能力，成为有效手段。然而，目前所发现的能够提高植物抗盐的基因还较少。

2、sos途径是植物进化出的主要抗盐途径之一，其中 sos1编码位于质膜上的na+/h +逆向转运蛋白，可以将细胞质中多余的na+排出体外，是植物关键的抗盐基因之一，公开号cn117624317a公开了sos1基因突变后可以大大提高酵母的耐盐性。当植物遭受盐胁迫时， sos1的转录水平会显著提升，合成更多的sos1蛋白帮助植物抵抗盐胁迫。因此，对于 sos1转录水平的监控能够较好的反映植物受到盐胁迫危害的程度，同时也能在一定程度上反映植物抗盐能力的高低。目前， sos1自身启动子驱动gus表达的转基因材料虽已有文献报道，但其灵敏度和精确性均较低，不利于育种家和农民对植物和农作物盐胁迫程度和抗盐能力的实时监测。此外，激活 sos1转录的上游转录因子的相关研究也较少，这极大的限制了植物抗盐性能的提升和改造工程。因此，挖掘新的提高sos1转录并增强植物抗盐性的基因，将有助于培育新型抗盐农作物。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出一种响应盐胁迫的人工启动子、报告系统和提高植物耐盐能力的方法，为将来从分子基因工程方面培育新抗盐品种提供了新的途径。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本申请提供了一段在 sos1基因第一个外显子上的一段经典的arf转录因子结合序列auxre（tgtctc），该序列可以更灵敏和准确的反映植物盐胁迫危害程度并有助于提高植物的抗盐能力。

4、响应盐胁迫的人工启动子，包括auxre序列和 sos1基因的天然启动子。

5、还包括 sos1基因从atg起始的前329 bp dna序列。

6、所述人工启动子的核苷酸序列（ sos1g+sos1pro）如seq id no.1所示。

7、包含上述人工启动子的报告系统，还包括与启动子3’端相连的报告基因。

8、上述报告基因为半乳糖干酶 gus基因或双荧光素酶 luc基因。

9、上述的报告系统的制备方法，将上述的人工启动子插入含有报告基因的中间载体的报告基因之前，即得报告系统。

10、具体为：将 sos1g+sos1pro序列构建到半乳糖干酶 gus基因或双荧光素酶 luc基因的前面，得 sos1g+sos1pro::gus质粒或 sos1g+sos1pro::luc质粒。

11、以半乳糖干酶 gus基因为例：将 sos1g+sos1pro::gus质粒即报告系统转化进农杆菌感受态gv3101，之后通过花序侵染法获得转基因拟南芥植物，用于监测土壤的盐胁迫程度。

12、一种监测盐胁迫程度的拟南芥报告株系的制备方法，上述的报告系统经遗传转化法转入拟南芥中，即得拟南芥报告株系。

13、一种提高植物耐盐能力的方法，步骤为：

14、（1）构建含有转录因子arf7的原核过表达载体；

15、（2）将上述的报告系统与步骤（1）中的原核过表达载体同时转染待改良植物即可。

16、上述步骤（1）中原核过表达载体为大肠杆菌表达质粒。

17、上述报告系统中的报告基因为 luc基因。

18、本发明具有以下有益效果：

19、本发明首先将包含auxre序列的 sos1基因的第一个外显子核酸序列（sos1g，长度为329 bp）添加至 sos1启动子前，合成出一段新型人工启动子片段sos1g+sos1pro并创制了sos1g+sos1pro::gus转基因gus报告株系，该株系能够通过简单的gus染色更为灵敏和精准的监测植物所遭受的盐胁迫程度；同时，本发明创制了auxre序列突变的 sos1突变体纯合回补株系，盐胁迫处理表型分析证实该序列的存在能够显著提高植物的抗盐性；本发明通过chip，emsa和luc实验，解析了生长素响应因子arf7结合该外显子上的auxre序列并激活 sos1表达，从而明显的增强植物的抗盐能力。

技术特征：

1.响应盐胁迫的人工启动子，其特征在于：所述人工启动子的核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.包含权利要求1所述的人工启动子的报告系统，其特征在于：还包括与启动子3’端相连的报告基因。

3.根据权利要求2所述的人工启动子的报告系统，其特征在于：所述报告基因为gus基因或luc基因。

4.权利要求2所述的报告系统的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的人工启动子插入含有报告基因的中间载体的报告基因之前，即得报告系统。

5.一种监测盐胁迫程度的拟南芥报告株系的制备方法，其特征在于：权利要求3所述的报告系统经遗传转化法转入拟南芥中，即得拟南芥报告株系。

6.一种提高植物耐盐能力的方法，其特征在于，步骤为：

7.根据权利要求6所述的提高植物耐盐能力的方法，其特征在于：所述步骤（1）中原核过表达载体为大肠杆菌表达质粒。

8.根据权利要求6所述的提高植物耐盐能力的方法，其特征在于：所述报告系统中的报告基因为luc基因。

技术总结本发明属于基因工程领域，涉及植物盐胁迫的监测和提高植物耐盐能力的方法。首先将包含AuxRE序列的SOS1基因的第一个外显子核酸序列添加至SOS1启动子前，合成出一段新型人工启动子片段SOS1g+SOS1pro并创制了SOS1g+SOS1pro::GUS转基因GUS报告株系，该株系能够通过简单的GUS染色更为灵敏和精准的监测植物所遭受的盐胁迫程度；同时，通过sos1突变体纯合回补株系，证明盐胁迫处理表型分析证实该序列的存在能够显著提高植物的抗盐性；还通过CHIP，EMSA和LUC实验，解析了生长素响应因子ARF7结合该外显子上的AuxRE序列并激活SOS1表达，从而明显的增强植物的抗盐能力。技术研发人员：刘文成,吕凯凯,杨蕻,廖才溢,宋如峰受保护的技术使用者：河南大学三亚研究院技术研发日：技术公布日：2024/11/18