一种羰基还原酶突变体、固定化羰基还原酶及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程和酶工程，具体涉及一种羰基还原酶突变体、固定化羰基还原酶及其应用。

背景技术：

1、醋酸艾司利卡西平（式ⅰ），又名艾司利卡西平醋酸酯，是一种新型的抗癫痫药物，可阻断电压门控钠通道活性，抑制脑部神经的异常放电。英文名称为eslicarbazepineacetate，化学名称为[(s)-(–)-10-乙酸-10 ,11-二氢-5h-二苯并[b ,f]氮杂-5-甲酰胺，分子式为c17h16n2o3，分子量296 .32，cas号236395-14-5，结构式如ⅰ。

2、醋酸艾司利卡西平合成的关键在于获得含有手性羟基的艾司利卡西（式ⅱ），现有文献报道的艾司利卡西平的制备方法主要分为两类，一类是化学催化法，其是使用各类催化物及氢供体还原奥卡西平生成艾司利卡西平，但反应过程中常常需要使用到一些昂贵的催化试剂，整体成本较高，反应路线长，最终产品难以保证较高的收率。

3、。

4、另外一类则是生物催化法，多使用全细胞或者胞内酶还原奥卡西平以获得艾司利卡西平。在现有文献报道中，工艺均为游离酶，游离酶在催化过程中不能被回收利用，并且会受到温度、ph、有机溶剂等因素的影响而导致酶活力下降，甚至丧失活性，使得催化剂成本高昂，同时易使体系带入酶蛋白等杂质，分离步骤较繁琐。为了提高酶的稳定性，促进其重复使用，便于后处理及连续的工业化生产，固定化酶技术被广泛应用，但在制备艾司利卡西平中仍无使用固定化酶的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本申请提供一种羰基还原酶突变体、固定化羰基还原酶及其应用。

2、为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本申请提供一种羰基还原酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其中，氨基酸突变的类型包括g44c、e105v和/或r209g。

4、在本申请的一种实施方式中，羰基还原酶和/或羰基还原酶突变体来源于希尔加第慢杆菌（ lentilactobacillushilgardii）。

5、第二方面，本申请提供一种编码羰基还原酶突变体的基因，其核苷酸序列如seqid no.2所示。

6、第三方面，本申请提供一种重组质粒，其包含编码羰基还原酶突变体的基因。

7、在本申请的一种实施方式中，重组质粒为pet系列载体。

8、第四方面，本申请提供一种重组菌株，其包含上述重组质粒。

9、在本申请的一种实施方式中，重组菌株为大肠杆菌。

10、第五方面，本申请提供一种利用羰基还原酶突变体制备固定化羰基还原酶的方法，包括以下步骤：

11、将羰基还原酶突变体粗酶液与壳聚糖微球混合，滴加戊二醛溶液，振荡交联，水洗，获得固定化羰基还原酶；

12、壳聚糖微球由壳聚糖溶于乙酸溶液中，注入到氢氧化钠溶液中，搅拌，水洗至中性获得。

13、在本申请的一种实施方式中，羰基还原酶突变体粗酶液的酶活为1-10u/g。

14、在本申请的一种实施方式中，壳聚糖与羰基还原酶突变体粗酶液的用量比为1g:80-120ml。

15、在本申请的一种实施方式中，壳聚糖与羰基还原酶突变体粗酶液的用量比为1g:100ml。

16、在本申请的一种实施方式中，乙酸溶液、氢氧化钠溶液、羰基还原酶突变体粗酶液、戊二醛溶液的体积比为1:1:1:0.1。

17、在本申请的一种实施方式中，乙酸溶液的浓度为0.5%-2%。

18、在本申请的一种实施方式中，氢氧化钠的浓度为0.5%-2%。

19、在本申请的一种实施方式中，戊二醛的浓度为4%-8%。

20、在本申请的一种实施方式中，振荡交联的温度为20-30℃，振荡交联的时间为1-3h。

21、在本申请的一种实施方式中，搅拌的温度为20-30℃，搅拌的时间为0.5-3h。

22、第六方面，本申请提供上述方法制备得到的固定化羰基还原酶。

23、第七方面，本申请提供固定化羰基还原酶在催化不对称还原制备艾司利卡西平中的应用。

24、在本申请的一种实施方式中，将含有底物奥卡西平的溶液和含有固定化羰基还原酶的溶液混合，混合液进行反应，制得艾司利卡西平。

25、在本申请的一种实施方式中，含有底物奥卡西平的溶液中含有缓冲溶液，缓冲溶液为pbs缓冲液。

26、在本申请的一种实施方式中，底物的浓度为80-150g/l。

27、在本申请的一种实施方式中，底物的浓度为100g/l。

28、在本申请的一种实施方式中，pbs缓冲液的浓度为50-300mmol/l。

29、在本申请的一种实施方式中，pbs缓冲液的浓度为100mmol/l。

30、在本申请的一种实施方式中，pbs缓冲液的ph值为6.0-9.0。

31、在本申请的一种实施方式中，pbs缓冲液的ph值为7.0。

32、在本申请的一种实施方式中，底物奥卡西平与固定化羰基还原酶的质量比为1:8-12。

33、在本申请的一种实施方式中，底物奥卡西平与固定化羰基还原酶的质量比为1:10。

34、在本申请的一种实施方式中，混合液中还含有葡萄糖、辅酶和gdh湿菌体。

35、在本申请的一种实施方式中，辅酶为β烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐。

36、在本申请的一种实施方式中，β烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐的浓度为0.1-0.5g/l。

37、在本申请的一种实施方式中，底物奥卡西平、葡萄糖、β烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐和gdh湿菌体的用量比为2:2:2:1。

38、在本申请的一种实施方式中，反应的温度为20-60℃。

39、在本申请的一种实施方式中，反应的温度为20-40℃。

40、在本申请的一种实施方式中，反应的温度为30℃。

41、在本申请的一种实施方式中，反应的时间为1-30h。

42、在本申请的一种实施方式中，反应的ph为6.0-9.0。

43、在本申请的一种实施方式中，制得的艾司利卡西平的手性纯度值大于99％。

44、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

45、（1）本申请提供一种羰基还原酶突变体，并提供一种固定化羰基还原酶的制备方法，通过该方法制得的固定化羰基还原酶的酶活力较野生型的增加了5-10倍，采用固定化羰基还原酶催化不对称还原制备艾司利卡西平时，底物浓度达到80-150g/l，手性纯度值大于99％，转化率大于99%。

46、（2）本发明固定化后的酶可以通过简单的过滤进行回收，回收后可以反复使用5次以上，且重复使用时与初次使用的反应手性纯度和转化率基本相同，具有较高的工业化应用潜力。

技术特征：

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的羰基还原酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，其包含权利要求2所述的编码羰基还原酶突变体的基因。

4.一种重组菌株，其特征在于，其包含权利要求3所述的重组质粒。

5.一种利用权利要求1所述的羰基还原酶突变体制备固定化羰基还原酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备固定化羰基还原酶的方法，其特征在于，所述羰基还原酶突变体粗酶液的酶活为1-10u/g，所述壳聚糖与羰基还原酶突变体粗酶液的用量比为1g:80-120ml，所述乙酸溶液、氢氧化钠溶液、羰基还原酶突变体粗酶液、戊二醛溶液的体积比为1:1:1:0.1；所述振荡交联的温度为20-30℃，所述振荡交联的时间为1-3h。

7.权利要求5至6任一项所述的方法制备得到的固定化羰基还原酶。

8.权利要求7所述的固定化羰基还原酶在不对称还原制备艾司利卡西平的应用，其特征在于，将含有底物奥卡西平的溶液和含有固定化羰基还原酶的溶液混合，混合液进行反应，制得艾司利卡西平。

9.根据权利要求8所述的固定化羰基还原酶在不对称还原制备艾司利卡西平的应用，其特征在于，所述含有底物奥卡西平的溶液中含有缓冲溶液，所述缓冲溶液为pbs缓冲液，所述底物的浓度为80-150g/l；所述底物奥卡西平与所述固定化羰基还原酶的质量比为1:8-12；所述混合液中还含有葡萄糖、辅酶和gdh湿菌体；所述辅酶为β烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐；所述反应的温度为20-60℃；所述反应的时间为1-30h；所述反应的ph为6.0-9.0。

10.权利要求7所述的固定化羰基还原酶在催化不对称还原制备艾司利卡西平中的应用，其特征在于，制得的艾司利卡西平的手性纯度值大于99％。

技术总结本发明公开了一种羰基还原酶突变体、固定化羰基还原酶及其应用，涉及基因工程和酶工程技术领域。羰基还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；将羰基还原酶突变体粗酶液与壳聚糖微球混合，滴加戊二醛溶液，振荡交联，水洗，获得固定化羰基还原酶。本申请制得的固定化羰基还原酶的酶活力较野生型的增加5‑10倍，采用固定化羰基还原酶催化不对称还原制备艾司利卡西平时，底物浓度达到80‑150g/L，手性纯度值大于99％，转化率大于99%。本发明固定化后的酶可以通过简单的过滤进行回收，回收后可以反复使用5次以上，且重复使用时与初次使用的反应手性纯度和转化率基本相同，具有较高的工业化应用潜力。技术研发人员：陈剑,余长泉,杨杰受保护的技术使用者：南京桦冠生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18