阿魏酰辅酶A6’-羟化酶表面突变体及其应用

本发明属于生物医药工程，具体涉及一种阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体及其应用。

背景技术：

1、香豆素(1,2-苯并吡喃酮)是重要的次级代谢产物，大量存在于植物、真菌和细菌等各种生物体内。由于特殊的结构，香豆素衍生物被发现具有多种生物活性，包括抗病毒、抗癌、抗高血压、抗高尿酸、抗菌、抗炎及抗凝血。此外，香豆素还具有独特的荧光特性。因此，香豆素类化合物被广泛应用在香料和化妆品、染料、抗氧化试剂等，是国内外化工和制药行业研究热点。

2、在植物和细菌的新陈代谢过程中，碳源可经过莽草酸代谢途径后可转化为l-酪氨酸，l-酪氨酸经酪氨酸解氨酶(tal)催化转化为对香豆酸(p-ca)，对香豆酸经黄素还原酶(fre)和对羟基苯乙酸-3-羟化酶(hpabc)催化转化为咖啡酸(ca)，咖啡酸经咖啡酸甲氧基转移酶(comt)催化转化为阿魏酸。以咖啡酸、阿魏酸等前体为原料，与对香豆酰辅酶a连接酶(4cl)和阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶(f6’h)结合进行秦皮乙素、东莨菪素的生物合成。上述两种香豆素通过一系列衍生反应，如羟基化、糖基化和异戊烯基化等可以合成各种高附加值香豆素类化合物，所以，秦皮乙素、东莨菪素是香豆素类化合物合成中重要的平台化合物，是合成其他香豆素类化合物的关键。如，巴斯夫等于2023年2月8日申请的wo2023156270a1中公开了香豆素合成及其用途(coumarin synthesis and usesthereof)，该专利申请中公开了东莨菪素、秦皮素、秦皮苷等的香豆素类化合物的生物合成路径。

3、现有技术中虽然公开了秦皮乙素、东莨菪素是香豆素类化合物合成中重要的平台化合物的生物合成路径，但是这些平台化合物还存在生物合成产率低等问题。

技术实现思路

1、经研究，阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶(f6’h)为生物合成香豆素类化合物的限速酶。因此，本发明的主要目的之一在于提供一种阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体，能够提高酶活性，有利于实现在不影响菌体生长的前提下有效提高生物合成香豆素类化合物的产量。

2、本发明的主要目的之二在于利用上述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体在生物合成香豆素类化合物中的应用，如，秦皮乙素、秦皮甲素、东莨菪素、秦皮素、秦皮苷和东莨菪苷，有利于实现香豆素类化合物的高效生物合成，尤其是有利于实现以简单碳源为源头，从头高效合成香豆素类化合物。其中，本发明中的“简单碳源”是指单糖、二糖或其任意组合。

3、具体地，本发明提供的技术方案如下：

4、一种阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶(f6’h1)表面突变体，主要是由seq id no.1所示的氨基酸序列发生氨基酸突变得到的，包括以下至少一种氨基酸突变：d102e、e163k、e190k、l196f、k199n。其中，突变体d102e代表第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸，突变体e163k代表第163位的谷氨酸突变为赖氨酸，突变体e190k代表第190位的谷氨酸突变为赖氨酸，突变体l196f代表第196位的亮氨酸突变为苯丙氨酸，突变体k199n代表第199位的赖氨酸突变为天冬酰胺。

5、所述氨基酸突变可以为单突变、双突变、三突变、四突变或五突变。所述氨基酸突变优选为d102e-e190k或d102e-e163k-e190k。其中，d102e-e190k突变为d102e和e190k两个位点同时突变的双突变，其代表第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸，同时第190位的谷氨酸突变为赖氨酸。d102e-e163k-e190k突变为d102e、e163k和e190k三个位点同时突变的三突变，其代表第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸，同时第163位的谷氨酸突变为赖氨酸，第190位的谷氨酸突变为赖氨酸。

6、所述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶(f6’h1)来源于拟南芥a.thaliana。

7、上述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体的获得方法，具体包括：通过易错pcr的方法设计阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶基因突变体库；通过建立的高通量筛选方法获得优势突变体；通过纯化蛋白和体外酶活实验结合的方法挑选出效果最佳的阿魏酰辅酶a6’-羟化酶表面突变体。

8、一种编码上述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶(f6’h1)突变体的基因。

9、一种重组质粒，该重组质粒连接有上述基因。优选地，所述质粒包括但不限于petduet-1、pze12-luc、pcs27或psa74。

10、一种上述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体在生物合成香豆素类化合物中的应用。其中，所述香豆素类化合物可以为秦皮乙素、秦皮甲素、菊苣苷、东莨菪素、秦皮素、秦皮苷和东莨菪苷等。

11、一种合成香豆素类化合物的工程菌，包括宿主菌和转化到所述宿主菌的上述重组质粒。其中，所述宿主菌为非植物细胞。优选地，所述宿主菌为原始或改造过的细菌、原始或改造过的真菌；例如原始或改造的大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或毕赤酵母(pichia pastoris)等。更优选地，所述宿主菌可以为大肠杆菌bw25113；进一步更优选地，所述大肠杆菌为bw25113δpyka/f::arogfbr::tyrafbr；如此敲除了丙酮酸激酶、解除了反馈抑制的磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶arogfbr以及分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶tyrafbr，能够提高由莽草酸途径合成酪氨酸的产量，从而实现增强上游途径的方式提高合成香豆素类化合物的工程菌从头合成香豆素类化合物的产量。

12、基上所述合成香豆素类化合物的工程菌，所述重组质粒中还同时连接有编码酪氨酸解氨酶(tal)、黄素还原酶(fre)、对羟基苯乙酸-3-羟化酶(hpabc)、咖啡酸甲氧基转移酶(comt)、对香豆酰-辅酶a连接酶(4cl)和香豆素合成酶(cosy)的基因，如此，所述工程菌为东莨菪素合成工程菌，能实现高效合成东莨菪素；尤其是能实现以简单碳源为源头，从头高效合成东莨菪素。另外，所述东莨菪素合成工程菌为简单香豆素合成工程菌，以其为出发菌可以构建东莨菪苷、秦皮素、秦皮苷等香豆素类化合物合成工程菌。

13、基上所述东莨菪素合成工程菌，所述重组质粒中还同时连接有编码东莨菪素-糖基转移酶的基因。如此，所述工程菌为东莨菪苷合成工程菌，能实现高效合成东莨菪苷；尤其是能实现以简单碳源为源头，从头高效合成东莨菪苷。

14、基上所述东莨菪素合成工程菌，所述重组质粒中还同时连接有编码东莨菪素-8-羟化酶(s8h)的基因，如此所述工程菌为秦皮素合成工程菌，能实现高效合成秦皮素；尤其是能实现以简单碳源为源头，从头高效合成秦皮素。另外，还能以秦皮素合成工程菌为出发菌构建秦皮苷等香豆素类化合物合成的工程菌。

15、基上所述秦皮素合成工程菌，所述重组质粒中还同时连接有编码秦皮素-8-o-糖基转移酶的基因，如此所述工程菌为秦皮苷合成工程菌，能实现高效合成秦皮苷；尤其是能实现以简单碳源为源头，从头高效合成秦皮苷。

16、基上所述合成香豆素类化合物的工程菌，所述重组质粒中还同时连接有编码酪氨酸解氨酶(tal)、黄素还原酶(fre)、对羟基苯乙酸-3-羟化酶(hpabc)、对香豆酰-辅酶a连接酶(4cl)和香豆素合成酶(cosy)的基因，如此，所述工程菌为秦皮乙素合成工程菌，能实现高效合成秦皮乙素；尤其是能实现以简单碳源为源头，从头高效合成秦皮乙素。另外，所述秦皮乙素合成工程菌为简单香豆素合成工程菌，以其为出发菌可以构建菊苣苷、秦皮甲素等香豆素类化合物合成工程菌。

17、基上所述秦皮乙素合成工程菌，所述重组质粒中还同时连接有编码东莨菪素-7-o-糖基转移酶(gt)的基因。如此，所述工程菌为菊苣苷合成工程菌，能实现高效合成菊苣苷；尤其是能实现以简单碳源为源头，从头高效合成菊苣苷。

18、基上所述秦皮乙素合成工程菌，所述重组质粒中还同时连接有编码秦皮乙素-6-o-糖基转移酶(ugt)的基因。如此，所述工程菌为秦皮甲素合成工程菌，能实现高效合成秦皮甲素；尤其是能实现以简单碳源为源头，从头高效合成秦皮甲素，且其从头合成产量可达到254.8mg/l。

19、在本发明中，所述酪氨酸解氨酶(tal)优选地来源于类球红细菌rhodobactersphaeroides、粘红酵母r.glutinis、白色链霉菌streptomyces albus、荚膜红杆菌rhodobacter capsulatus或棘孢小单孢菌micromonospora echinofusca等；所述对香豆酰-辅酶a连接酶(4cl)优选地来源于拟南芥arabidopsis thaliana或欧芹petroselinumcrispum等。所述黄素还原酶(fre)来源于大肠杆菌escherichia coli，所述对羟基苯乙酸-3-羟化酶(hpabc)来源于克雷伯氏菌klebsiella pneumonia；所述咖啡酸甲氧基转移酶(comt)来源于拟南芥arabidopsis thaliana。所述香豆素合成酶(cosy)源于拟南芥a.thaliana、马铃薯solanum tuberosum或大豆glycine max等。所述东莨菪素-8-羟化酶(s8h)来源于拟南芥arabidopsis thaliana。所述秦皮素-8-o-糖基转移酶ugt71e来源于拟南芥arabidopsis thaliana，可以为ugt71e1、ugt71e2、ugt71e3。所述东莨菪素-糖基转移酶gt来源于烟草nicotiana tabacum或拟南芥arabidopsis thaliana，可以为7-o-糖基转移酶或8-o-糖基转移酶，具体如togt1、togt2、ugt71e1、ugt71e2、ugt71e3等。所述秦皮乙素-6-o-糖基转移酶ugt来源于金钱槭dipteronia sinensis，如ugt92g7、ugt84a62等。

20、一种香豆素类化合物的生物合成方法，包括：按照体积分数1％～10％的接种量，将上述合成香豆素类化合物的工程菌接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到香豆素类化合物的步骤。其中，所述接种量优选为2％～5％；所述发酵温度优选为30℃～40℃进行发酵处理；所述发酵培养基优选地包括：0.5～1.5g/l feso4、1～5g/l mops、5～20g/l碳源、1～5g/l酵母粉、5～8g/l na2hpo4、0.3～2g/l nacl、2.3～4.0g/l kh2po4和1～5g/l nh4cl。

21、所述发酵培养基中的碳源为单糖、二糖或其任意组合。优选地，所述发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖中的一种或任意组合。其中，上述发酵培养过程中，加入0.25～1mm的诱导剂iptg。

22、进一步，上述合成方法还包括先向所述发酵培养基中添加中间化合物，再对所述工程菌进行发酵培养的步骤；其中，所述中间化合物为合成目标化合物路径上的中间体，优选为酪氨酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、东莨菪素、秦皮素和秦皮乙素中的至少一种。

23、因此，本发明提供的上述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体在野生型阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶的基础上通过随机突变技术进行突变得到的，能够提高阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶的活性，经试验，所述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶突变体的酶活性提高了1.7以上，甚至可以提高8.4倍；与利用野生型的阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶构建的工程菌相比，利用所述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体构建的工程菌，可使东莨菪素的产量提高约8.4倍、秦皮乙素的产量提高约5.1倍。

24、进一步，本发明利用上述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体首次实现以简单碳源为源头，从头高效生物合成东莨菪素、秦皮素、秦皮苷、东莨菪苷、秦皮乙素、秦皮甲素、菊苣苷，产量分别为49.3mg/l、45.8mg/l、101.2mg/l、79.8mg/l、78.6mg/l、254.8mg/l、73.9mg/l。

25、进一步，利用本发明提供的含有上述阿魏酰辅酶a 6’-羟化酶表面突变体编码基因的工程菌生产香豆素类化合物具有产量高、种类多优点，有利于工业化放大生产，降低生产成本，为香豆素类化合物工业化生产提供了重要的依据。