与高粱株高相关的分子标记SbPH1及其应用

本发明涉及遗传工程领域中与高粱株高相关的分子标记sbph1及其应用。

背景技术：

1、单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，snp)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的dna序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等。snp标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，snp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。

2、高粱(sorghum bicolor)又叫蜀黍，为禾本科高粱属一年生草本植物，高粱是世界五大作物之一，属于c4作物，光合效率高，生物产量高。高粱的用途很广泛，可食用、饲用、酿造用、生物能源用、化工材料用等。高粱因具有耐旱涝、耐盐碱、耐贫瘠和易于种植等特性，是全球最重要的粮食作物和饲料作物。

3、株高是作物形态学调查基本指标,也是影响高粱生物产量重要因素，一般高粱株高越高，其生物产量也越高，大多数高秆品种的生物产量都高于矮秆品种的产量。因此，选育含有高秆单倍型的高粱亲本系及杂交种成为促进高粱产业发展的关键。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题提供一种与高粱株高相关的分子标记。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定高粱株高的方法。

3、所述方法包括检测待测高粱中snp1和snp2这两个snp的基因型，根据待测高粱的所述基因型鉴定或辅助鉴定高粱株高：

4、所述基因型为ttaa的高粱株高高于或候选高于所述基因型为ccaa和所述基因型为ccgg的高粱株高，所述基因型为ccaa的高粱株高高于或候选高于所述基因型为ccgg的高粱株高；所述ttaa是所述snp1的基因型为tt且所述snp2的基因型为aa两个snp组合基因型，所述基因型ccgg是所述snp1的基因型为cc且所述snp2的基因型为gg的两个snp组合基因型，所述基因型ccaa是所述snp1的基因型为cc且所述snp2的基因型为aa两个snp组合基因型；所述snp1的基因型为tt是序列表中seq id no.1的第2124位核苷酸为t的纯合型；所述snp1的基因型为cc是序列表中seq idno.1的第2124位核苷酸为c的纯合型；所述snp2的基因型为gg是序列表中seq idno.1的第1659位核苷酸为g的纯合型；所述snp2的基因型为a是序列表中seq id no.1的第1659位核苷酸为a的纯合型；

5、所述snp1是高粱基因组的一个单核苷酸多态性位点，为序列表中seq id no.1的第2124位核苷酸，其为c或t；所述snp2是高粱基因组的一个单核苷酸多态性位点，为序列表中seq id no.1的第1659位核苷酸，其为g或a。

6、作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定高粱株高方法可包括如下步骤：

7、(1)以待测高粱的基因组dna为模板，采用引物组f1和引物组f2进行检测；

8、引物组f1可包括引物f1-a、引物f1-b和引物f1-c；所述引物组合f2可包括引物f2-a、引物f2-b和引物f2-c；

9、所述引物f1-a可为核苷酸序列是序列表中序列2的单链dna分子；

10、所述引物f1-b可为核苷酸序列是序列表中序列3的单链dna分子；

11、所述引物f1-c可为核苷酸序列是序列表中序列4的单链dna分子；

12、所述引物f2-a可为核苷酸序列是序列表中序列5的单链dna分子；

13、所述引物f2-a可为核苷酸序列是序列表中序列6的单链dna分子；

14、所述引物f2-a可为核苷酸序列是序列表中序列7的单链dna分子。

15、(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测高粱的所述snp1和所述snp2位点的基因型；

16、(3)根据基因型结果进行鉴定或辅助鉴定高粱株高：所述snp1和所述snp2这两个snp位点的基因型为基因型ttaa的待测高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于所述基因型ccaa的待测高粱株高(如高粱自交系)；所述基因型ccaa的待测高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于所述基因型ccgg的待测高粱株高(如高粱自交系)。

17、上述方法在高粱育种中的应用。

18、为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述应用。

19、检测snp1和snp2这两个snp的多态性或基因型的物质的在鉴定或辅助鉴定高粱株高，或，制备鉴定或辅助鉴定高粱株高产品，或，高粱育种或制备高粱育种产品中的应用，所述snp1是高粱基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第2124位核苷酸，其为c或t；所述snp2是高粱基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第1659位核苷酸，其为g或a。

20、本技术中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述qgl1b.1位点的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。

21、所述物质可为产品。所述检测物质可包括检测上述单核苷酸多态性的试剂、试剂盒和仪器。具体的说，为检测上述单核苷酸多态性进行核酸体外扩增所需的引物和其他试剂和仪器。

22、所述seq id no.1为sbph1的基因的基因组序列，其包括内含子序列。在实际检测过程中snp1和snp2的多态性可通过检测由snp1和snp2的多态性引起的sbph1基因转录的mrna、sbph1mrna反转录的cdna的核苷酸多态性或sbph1蛋白质氨基酸的多态性来检测分析。

23、本技术中，所述snp1的基因型可为基因型tt或基因型cc，snp1的基因型tt是snp1为t的纯合型；snp1的基因型cc是snp1为c的纯合型合型。

24、所述snp2的基因型可为基因型gg或基因型aa，snp2的基因型gg是snp2为g的纯合型；snp2的基因型aa是snp2为a的纯合型合型。

25、以高粱基因组(btx623(v3.1)为参考基因组，snp1位于高粱自交系btx623第2号染色体上第6591060位的互补位。

26、以高粱基因组(btx623(v3.1)为参考基因组，snp2位于高粱自交系btx623第2号染色体上第6591525位的互补位。

27、为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定高粱株高的产品。

28、所述产品含有上述检测高粱基因组snp1和snp2这两个snp的多态性或基因型的物质，所述物质为下述任一种：

29、d1)含有特异性扩增所述两个snp的体外核酸扩增引物；

30、d2)含有d1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；

31、d3)含有d1)所述体外核酸扩增引物或d2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒。

32、所述体外核酸扩增引物包括引物组引物组f1和/或引物组f2；

33、所述引物组f1为f1-a、f1-b或f1-c：

34、f1-a是序列表中seq id no.2的第22-43位的单链dna；f1-a是序列表中seqidno.2的单链dna。

35、f1-b是序列表中seq id no.3的第22-43位的单链dna；f1-a是序列表中seqidno.3的单链dna。

36、f1-c是序列表中seq id no.4的单链dna。

37、f2-a是序列表中seq id no.5的第22-43位的单链dna；f1-a是序列表中seq idno.2的单链dna。

38、f2-b是序列表中seq id no6的第22-44位的单链dna；f1-a是序列表中seq idno.3的单链dna。

39、f2-c是序列表中seq id no.7的单链dna。

40、上述的方法、上述的应用或上述的产品中，所述高粱为高粱纯系或自交系。

41、上述的方法、上述的应用或上述的产品中，所述育种的目的包括培育或选育低株高或高株高的高粱。

42、上述的方法、上述的应用或上述的产品或上述的应用或方法中，所述检测snp1和snp2这两个snp的多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，为如下d1)、d2)、d3)或d4)：

43、d1)含有特异性扩增snp1和snp2位点的体外核酸扩增引物；

44、d2)含有d1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；

45、d3)含有d1)所述体外核酸扩增引物或d2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；

46、d4)含有d1)所述体外核酸扩增引物、d2)所述体外核酸扩增试剂或d3)所述试剂盒的检测仪器。

47、所述体外核酸扩增技术可为聚合酶链式反应(pcr)、链替代扩增(sda)、连接酶链式反应(lcr)和依赖核酸序列的扩增(nasba)、滚环核酸扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、依赖解旋酶的等温扩增技术(hda)或qβ复制技术。

48、本技术以聚合酶链式反应(pcr)为扩增手段，进行多态性检测。

49、d1)中所述特异性扩增可通过扩增产物的有无或者通过扩增产物的有无再结合探针等辅助试剂来检测snp1和snp2多态性位点的核苷酸序列。

50、上述应用、方法和产品中，所述体外核酸扩增引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测。

51、所述体外核酸扩增引物包括引物组引物组f1和/或引物组f2；

52、所述引物组f1为f1-a、f1-b或f1-c：

53、f1-a是序列表中seq id no.2的第22-43位的单链dna；f1-a是序列表中seq idno.2的单链dna。

54、f1-b是序列表中seq id no.3的第22-43位的单链dna；f1-a是序列表中seqidno.3的单链dna。

55、f1-c是序列表中seq id no.4的单链dna。

56、f2-a是序列表中seq id no.5的第22-43位的单链dna；f1-a是序列表中seqidno.2的单链dna。

57、f2-b是序列表中seq id no6的第22-44位的单链dna；f1-a是序列表中seq idno.3的单链dna。

58、f2-c是序列表中seq id no.7的单链dna。

59、为了解决上述技术问题，本发明还提供了高粱育种的方法。

60、所述方法包括检测高粱的基因型，选择基因型为上述ttaa的高粱作为亲本进行育种。

61、为了解决上述技术问题，本发明还提供了高粱育种的方法。

62、所述方法包括检测高粱的基因型，选择基因型为上述ccgg的高粱作为亲本进行育种。

63、本发明提供了两种高粱育种的方法，分别为m1和m2：

64、m1、高粱育种的方法，所述方法包括检测高粱的基因型，选择基因型为所述ttaa的高粱作为亲本进行育种。

65、m1中的所述高粱育种的包括选育高株高的高粱。所述方法可包括将所述亲本与基因型为非ttaa的另一亲本进行杂交，所述高株高的高粱的株高高于所述另一亲本。

66、m2、高粱育种的方法，所述方法包括检测高粱的基因型，选择基因型为所述ccgg的高粱作为亲本进行育种。

67、m2中的所述高粱育种的包括选育高株低的高粱。所述方法可包括将所述亲本与基因型为非ccgg的另一亲本进行杂交，所述低株高的高粱的株高低于所述另一亲本。

68、所述植物为纯合植株。

69、所述植物育种的方法可为将所有染色体上的序列1区域的2124位核苷酸和1659位核苷酸均进行替换得到纯合植株。或先将一条染色体上的序列1区域的进行替换再通过有性繁殖进行纯合筛选获得纯合植株。

70、为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述应用。

71、基因组中序列1区域第2124位核苷酸为t且第1659位核苷酸为a、第2124位核苷酸为c且第1659位核苷酸为a或第2124位核苷酸为c且第1659位核苷酸为g对应不同株高在下任一中的应用：

72、(1)调控高粱株高；

73、(2)制备调控高粱株高的产品；

74、(3)高粱育种；

75、(4)制备高粱株高育种产品；

76、(5)检测高粱株高相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

77、(6)鉴定或辅助鉴定高粱株高的产品。

78、上文中，所述植物可为高粱。

79、所述植物基因组中序列1区域的第2124位核苷酸为t且第1659位核苷酸为a的植物株高高于或候选高于所述目的植物基因组中序列1区域的第2124位核苷酸为c且第1659位核苷酸为a的植物，所述植物基因组中序列1区域的第2124位核苷酸为c且第1659位核苷酸为a的植物株高高于或候选高于所述目的植物基因组中序列1区域的第2124位核苷酸为c且第1659位核苷酸为g的植物。

80、所述植物为纯合植株。

81、所述高粱可为下述中的至少一种作为亲本得到的杂交后代：

82、高粱品种125、高粱品种136、高粱品种139、高粱品种170、高粱品种175、高粱品种2026、高粱品种264、高粱品种377、高粱品种400、高粱品种84、高粱品种86、高粱品种sl105、高粱品种sl141、高粱品种wsc102、高粱品种wsc106、高粱品种wsc33、高粱品种wsc60、高粱品种wsc94、高粱品种wsc18、高粱品种16、高粱品种2012、高粱品种2013、高粱品种2054、高粱品种2068、高粱品种2069、高粱品种262、高粱品种346、高粱品种4、高粱品种63、高粱品种6、高粱品种j100、高粱品种j22、高粱品种j57、高粱品种j89、高粱品种sl129、高粱品种wsc32、高粱品种wsc34、高粱品种159、高粱品种2061、高粱品种j146、高粱品种j53、高粱品种j95、高粱品种107、高粱品种110、高粱品种132、高粱品种150、高粱品种177、高粱品种2017、高粱品种2018、高粱品种2019、高粱品种2021、高粱品种2029、高粱品种2042、高粱品种2048、高粱品种2050、高粱品种2059、高粱品种205、高粱品种2085、高粱品种2088、高粱品种24、高粱品种251、高粱品种253、高粱品种255、高粱品种258、高粱品种259、高粱品种267、高粱品种268、高粱品种271、高粱品种272、高粱品种275、高粱品种277、高粱品种279、高粱品种281、高粱品种286、高粱品种348、高粱品种351、高粱品种354、高粱品种356、高粱品种357、高粱品种359、高粱品种364、高粱品种367、高粱品种372、高粱品种384、高粱品种386、高粱品种392、高粱品种394、高粱品种395、高粱品种396、高粱品种43、高粱品种59、高粱品种60、高粱品种62、高粱品种73、高粱品种77、高粱品种88、高粱品种gw59、高粱品种j150、高粱品种j158、高粱品种j159、高粱品种j25、高粱品种j26、高粱品种j42、高粱品种j49、高粱品种j67、高粱品种j69、高粱品种j77、高粱品种j79、高粱品种j81、高粱品种j87、高粱品种j93、高粱品种j97、高粱品种j99、高粱品种j9、高粱品种wsc10、高粱品种wsc16、高粱品种wsc2、高粱品种wsc50、高粱品种wsc5、高粱品种wsc66、高粱品种wsc75、高粱品种wsc86、高粱品种wsc8、高粱品种92、高粱品种wsc24、高粱品种124、高粱品种147、高粱品种183、高粱品种2008、高粱品种2016、高粱品种2031、高粱品种2037、高粱品种260、高粱品种j27、高粱品种101、高粱品种11、高粱品种122、高粱品种127、高粱品种128、高粱品种131、高粱品种135、高粱品种14、高粱品种154、高粱品种163、高粱品种167、高粱品种174、高粱品种176、高粱品种190、高粱品种192、高粱品种194、高粱品种197、高粱品种2002、高粱品种2007、高粱品种2009、高粱品种2010、高粱品种2023、高粱品种2027、高粱品种2030、高粱品种2035、高粱品种2036、高粱品种2038、高粱品种2052、高粱品种2056、高粱品种2062、高粱品种2065、高粱品种2066、高粱品种2067、高粱品种206、高粱品种2070、高粱品种2071、高粱品种2075、高粱品种2076、高粱品种2078、高粱品种2080、高粱品种20、高粱品种252、高粱品种254、高粱品种256、高粱品种257、高粱品种261、高粱品种263、高粱品种265、高粱品种270、高粱品种30、高粱品种31、高粱品种355、高粱品种36、高粱品种370、高粱品种374、高粱品种37、高粱品种45、高粱品种48、高粱品种51、高粱品种53、高粱品种54、高粱品种56、高粱品种70、高粱品种76、高粱品种7、高粱品种80、高粱品种81、高粱品种89、高粱品种8、高粱品种91、高粱品种95、高粱品种98、高粱品种gw102、高粱品种j130、高粱品种j136、高粱品种j14、高粱品种j152、高粱品种j20、高粱品种j28、高粱品种j2、高粱品种j40、高粱品种j44、高粱品种j50、高粱品种j54、高粱品种j85、高粱品种j88、高粱品种mhmd、高粱品种sl130、高粱品种wsc100、高粱品种wsc105、高粱品种wsc19、高粱品种wsc25、高粱品种wsc29、高粱品种wsc56、高粱品种wsc59、高粱品种wsc68、高粱品种wsc6、高粱品种wsc81、高粱品种wsc93、高粱品种wsc97、高粱品种wsc98。

83、所述杂交后代可为f2代及其以上世代，如f2代，bc1f2等。

84、上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述snp的多态性或基因型所需的试剂和/或试剂盒和/或仪器：体外核酸扩增、dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。

85、上文所述应用及方法中，可选择高粱自交系作为亲本进行育种。

86、上文所述高粱株高具体可为高粱成熟期的株高。

87、所述育种的目的包括培育或选育低株高或高株高的高粱。

88、上述应用和方法中，所述pcr引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

89、上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由pcr引物、parms master mix试剂、酶标仪和在线软件snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由pcr引物、parms master mix试剂、在线软件snp decoder和荧光定量pcr仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测高粱基因组中snp1和/或snp2位点的多态性或基因型的物质。

90、有益效果

91、本发明通过对235个高粱种类分析发现鉴定高粱株高的方法及所用snp标记sbph1及其应用。该单倍型组合包括2个snp位点，分别为snp1和snp2，其中snp1对应于高粱自交系btx623第2号染色体上第6591060位(btx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为g或a，具体地snp1为序列1的第2124位核苷酸，其为c或t。snp2对应于高粱自交系btx623第2号染色体上第6591525位，其核苷酸为c或t，具体地snp2为序列1的第1659位核苷酸，其为g或a。

92、基因型为ttaa的高粱株高高于或候选高于所述基因型为ccaa和所述基因型为ccgg的高粱株高，所述基因型为ccaa的高粱株高高于或候选高于所述基因型为ccgg的高粱株高；所述ttaa是所述snp1的基因型为tt且所述snp2的基因型为aa两个snp组合基因型，所述基因型ccgg是所述snp1的基因型为cc且所述snp2的基因型为gg的两个snp组合基因型，所述基因型ccaa是所述snp1的基因型为cc且所述snp2的基因型为aa两个snp组合基因型；所述snp1的基因型为tt是序列表中seq id no.1的第2124位核苷酸为t的纯合型；所述snp1的基因型为cc是序列表中seq id no.1的第2124位核苷酸为c的纯合型；所述snp2的基因型为gg是序列表中seq id no.1的第1659位核苷酸为g的纯合型；所述snp2的基因型为a是序列表中seq id no.1的第1659位核苷酸为a的纯合型.

93、并根据上述snp设计了kasp检测引物：特异性引物f1-a(seq id no.2)：5’-gaaggtgaccaagttcatgctcgttcatgcagttcgagacgac-3’特异性引物f1-b(seq idno.3)：5’-gaaggtcggagtcaacggattcgttcatgcagttcgagacgat-3’通用引物f1-c(seq id no.4)：5’-accacgggtcgcccccctt-3’鉴定snp2位点多态性的引物组f2如下：特异性引物f2-a(seq idno.5)：5’-gaaggtgaccaagttcatgctcattctccacaagagtgctgcg-3’特异性引物f2-b(seqidno.6)：5’-gaaggtcggagtcaacggattgcattctccacaagagtgctgca-3’通用引物f2-c(seq idno.7):5’-gtggatcagctcatcatgggtactt-3’

94、上述序列seq id no.2与seq id no.4所示的单链dna分子扩增序列表seq idno.1中snp1位点为c的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到模板中与fam序列结合的荧光基团的荧光信号；上述序列seq id no.3与seq id no.4所示的单链dna分子扩增序列表seq id no.1中snp1位点为t的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到模板中与hex序列结合的荧光基团的荧光信号。上述序列seq id no.5与seq id no.7所示的单链dna分子扩增序列表seq id no.1中snp2位点为g的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到模板中与fam序列结合的荧光基团的荧光信号；上述序列seq id no.6与seq id no.7所示的单链dna分子扩增序列表seq id no.1中snp2位点为a的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到模板中与hex序列结合的荧光基团的荧光信号。