肿瘤特异性免疫细胞标志物及其用途的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及肿瘤特异性免疫细胞标志物及其用途。

背景技术：

1、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,til)治疗在近年已经成为肿瘤免疫细胞治疗技术中针对实体瘤的一类重要疗法，对多种实体瘤，如黑色素瘤、宫颈癌、头颈部肿瘤和非小细胞肺癌在临床上都取得了非常显著的效果。til中以t细胞为主要组分，其是一群异质性的t细胞，包括肿瘤特异性(tumor-specific)t细胞与旁观者(bystander)t细胞，即特异性识别肿瘤抗原的t细胞与识别与肿瘤无关的抗原表位的t细胞。旁观者til通常包括识别病毒抗原，如ebv、hcmv和流感病毒抗原表位的t细胞。在til作为过继性t细胞疗法(act)治疗肿瘤的背景下，如何提升til中肿瘤特异性t细胞的含量、降低旁观者t细胞的占比并获得能够在体内长期存续的til细胞群成为提升疗效的至关重要的因素。

2、已公开的报道中提到了多种不同指标用以区分til中的肿瘤特异性t细胞群与旁观者t细胞群。thomas duhen et al.nat commun.2018jul 13；9(1):2724.记载了在多种原发与转移灶肿瘤cd8+til细胞中，cd39+cd103+细胞群中高度富集存在肿瘤抗原特异性t细胞。kim e kortekaas et al.cancer immunol res.2020oct；8(10):1311-1321.记载了肿瘤特异性的cd4+t细胞集中存在于cd39+til亚群中。wo2021226085a1公开了一种扩增临床治疗用途til的方法，其中包括了对特定指标表达阳性til的分选步骤，特定指标包括pd-1、cd39、cd38、cd103、cd101、lag3、tim3和/或tigit。但目前仍然需要更加准确有效的标准对til进行鉴定和/或分选，用以确定制备获得的til细胞中肿瘤特异性和肿瘤反应性t细胞的比例，以及可能地对这一部分细胞后续进行进一步分选和扩增以提升til的临床疗效。

技术实现思路

1、本发明第一方面提供一种免疫细胞标志物组合，包括：(1)免疫细胞活化标志物，和(2)免疫细胞抑制标志物，

2、任选地还包括(3)胞内标志物，和/或(4)组织驻留记忆标志物。

3、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞活化标志物为免疫细胞表面标志物。

4、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞活化标志物包括选自cd25、cd38、cd69、cd137、cd107a、cd226、cd150和ly108中的一种或多种。

5、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞抑制标志物包括选自cd39、pd-1、tim3、lag3、ctla-4、tigit、cd101、cd160和cd161中的一种或多种。

6、在一个或多个实施方案中，所述胞内标志物包括：胞内细胞因子和/或免疫细胞胞内活化标志物。优选地，所述胞内细胞因子包括选自胞内ifn-γ、tnf-a、cxcl10、cxcl13、il-2、il-4、il-6、il-8和il-10中的任一种或多种；优选地，所述胞内活化标志物包括选自胞内cd137、胞内cd69和胞内cd107a中的任一种或多种。

7、在一个或多个实施方案中，所述组织驻留记忆标志物包括选自cd69、cd103和cd49a中的任一种或多种。

8、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞或til。

9、本发明还提供检测本文任一实施方案所述的标志物组合的试剂，所述试剂是特异性识别各标志物的结合分子。

10、在一个或多个实施方案中，所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。

11、在一个或多个实施方案中，所述结合分子偶联有可检测标记物，例如生物素或荧光基团。

12、本发明还提供一种组合物，包含本文任一实施方案所述的标志物组合或试剂。

13、本发明还提供一种鉴定或制备肿瘤特异性免疫细胞的试剂盒，包含本文任一实施方案所述的标志物组合、试剂、或组合物。

14、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞或til。

15、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括免疫反应试剂。优选地，所述免疫反应试剂包括封闭液、洗涤液、酶标试剂。

16、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒适用于本文任一实施方案所述的用途或方法。

17、本发明还提供鉴定肿瘤特异性免疫细胞的方法，包括检测免疫细胞的本文所述的免疫细胞标志物组合的表达，其中表达阳性的是肿瘤特异性免疫细胞。

18、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞或til。

19、本发明还提供筛选肿瘤特异性免疫细胞的方法，包括筛选免疫细胞群中本文所述的免疫细胞标志物组合表达阳性的细胞。

20、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞或til。

21、本文任一实施方案所述的标志物组合或试剂在制备产品中的用途，所述产品用于鉴定或制备肿瘤特异性免疫细胞。

22、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞或til。

23、在一个或多个实施方案中，所述产品是试剂盒或装置。

24、本发明提供制备肿瘤特异性免疫细胞的方法，包括：从分离的肿瘤浸润淋巴细胞中筛选本文所述的免疫细胞标志物组合表达阳性的细胞。

25、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞、nk细胞或nkt细胞。

26、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括从肿瘤样品获得分离的肿瘤浸润淋巴细胞的步骤；具体包括：

27、(1.1)从肿瘤样品获得种子细胞，例如使用种子细胞培养基培养肿瘤样品获得种子细胞，和

28、(1.2)培养种子细胞获得分离的肿瘤浸润淋巴细胞。

29、在一个或多个实施方案中，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞来源于选自下组的样品：有需要的受试者的腹水、手术切除原发灶样品、同时性和异时性手术切除转移灶样品、穿刺样品和体液。所述体液包括血液、组织液、淋巴液和/或体腔积液。

30、在一个或多个实施方案中，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞来源于选自下组的肿瘤：黑色素瘤、胶质瘤、胃癌、肺癌、胃肠道间质瘤、肠癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜间质肉瘤、盆腔低分化腺癌和胆管癌。

31、在一个或多个实施方案中，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞来自肿瘤组织被切割后的组织块，所述肿瘤组织被切割后的组织块的直径为约1mm-约10mm。

32、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括进一步培养获得的肿瘤特异性免疫细胞。

33、本文所述制备肿瘤特异性免疫细胞的方法制得的肿瘤特异性免疫细胞在制备癌症治疗药物中的应用。

34、本发明的标志物组合能够更加准确地鉴定和富集肿瘤特异性免疫细胞，富集的细胞群具有更好的肿瘤反应性和肿瘤杀伤功能。