分离、测定那屈肝素钙中的寡糖并建立质谱库的方法与流程

本发明属于多组分生化药品检测，具体涉及一种分离、测定那屈肝素钙中的寡糖并建立质谱库的方法。

背景技术：

1、肝素是哺乳动物中提取的一种高度硫酸化的糖胺聚糖，可抑制体内、体外血栓和动静脉血栓的形成。使用普通肝素作为原料一次投料，亚硝酸降解后得到低分子肝素，通过乙醇分级沉淀的方法制备得到达肝素钠；乙醇分级沉淀过程中的上层料液经回收，再经过乙醇分级沉淀，钠钙置换，制备得到那屈肝素钙。那屈肝素钙和达肝素钠均为低分子量肝素的一种，都是亚硝酸钠裂解而制得，其结构通式十分相似。与普通肝素相比，这两种低分子肝素在抗血栓形成、生物利用度和出血不良反应等方面具有明显优势，已广泛应用于临床。基于生物来源药品的复杂性，那屈肝素钙的结构一致性确证研究是该类药物药学研究的重点和难点，也是研发单位在该类品申报时存在问题较多的部分。在进行该类药物的仿制研究时，有必要明确其结构。

2、近年来，uplc-qtof-ms技术因其具有简便、快捷且准确度高，能直观的评估样品的一致性等特点，逐渐成为表征低分子肝素中的寡糖指纹图谱的主要手段。例如，发明专利cn116297984a公开了一种采用lc-ms检测低分子肝素中寡糖含量的方法及应用，该专利中低分子肝素具体指依诺肝素钠。虽然依诺肝素钠和那屈肝素钙均为低分子肝素，但与那屈肝素钙的制备工艺完全不同，特征结构存在较大的差异。那屈肝素钙与依诺肝素钠的质谱库完全不同，简单套用依诺肝素钠的检测方法并不能获得较为准确的结果；并且该检测方法耗时较长(100min)，不经济，不适合广泛推广使用。发明专利cn115032294a公开了一种达肝素钠寡糖检测的新方法，包括：用肝素酶i酶解达肝素钠后，采用分子排阻色谱分离出混合四糖组分及混合六糖组分；将分离出的混合四糖组分及混合六糖组分采用真空离心浓缩；采用阴离子交换-高效液相色谱法分离浓缩后的混合四糖组分及混合六糖组分，以用于结构对比。同样的，达肝素钠和那屈肝素钙在结构上存在一定差异，该方法无法实现那屈肝素钙中寡糖的检测。并且该方法也存在耗时长的问题。

3、因此，有必要开发一种耗时短、易推广的那屈肝素钙检测方法，以建立结构清晰、分子式明确的那屈肝素钙质谱库。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于uplc-qtof-ms法分离那屈肝素钙中寡糖组分和/或寡糖片段的方法，该方法分离效果好，分离时间短，为那屈肝素钙质谱库的建立提供了支持。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、基于uplc-qtof-ms法分离那屈肝素钙中寡糖组分和/或寡糖片段的方法，所述方法包括：

4、(1)分离那屈肝素钙中寡糖组分的top-down法；所述top-down法是通过如下梯度洗脱程序分离那屈肝素钙中的寡糖：

5、0-40min，设置所述流动相a的体积分数为10％-35％，所述流动相b的体积分数为90％-65％，洗脱方式为梯度洗脱；

6、40.01-55min，设置所述流动相a的体积分数为90，所述流动相b的体积分数为10％，洗脱方式为等度洗脱；

7、55.01-70min，设置所述流动相a的体积分数为10％，所述流动相b的体积分数为90％，洗脱方式为等度洗脱；

8、和/或(2)分离那屈肝素钙中寡糖片段的bottom-up法；所述bottom-up法是采用如下梯度洗脱程序分离那屈肝素钙中肝素酶酶解的寡糖片段：

9、0-10min，设置所述流动相a的体积分数为10％-35％，所述流动相b的体积分数为90％-65％，洗脱方式为梯度洗脱；

10、10.01-25min，设置所述流动相a的体积分数为90％，所述流动相b的体积分数为10％，洗脱方式为等度洗脱；

11、25.01-40min，设置所述流动相a的体积分数为10％，所述流动相b的体积分数为90％，洗脱方式为等度洗脱；

12、所述top-down法和bottom-up法均以乙酸铵溶液为流动相a，乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液作为流动相b，所述流动相b中，乙酸铵溶液和乙腈的体积比1：15-25。

13、与蛋白质组学分析类似，对低分子肝素的质谱结构解析包括top-down(自上而下)和bottom-up(自下而上)两种策略。top-down策略，是直接对比解析低分子肝素的糖链结构，包括定性、定量分析。bottom-up策略，是用肝素酶将低分子肝素特异性切割为不同聚合度的糖链片段，把识别到的糖链片段的质谱峰列入质谱库，然后对降解所得的低聚糖链进行定性、定量分析。本发明使用的肝素裂解酶为肝素酶i(heparinase i)、肝素酶ii(heparinase ii)和肝素酶iii(又名硫酸乙酰肝素)。肝素酶i、ii和iii具有非常不同的专属性，肝素酶i主要选择性切割高硫酸化的糖链片段，得到三硫酸化的肝素寡糖；肝素酶ii酶切的作用位点，选择特异性低，得到硫酸化程度不同的肝素寡糖混合物；肝素酶iii选择性切割低酸化的区域。由于肝素酶i主要针对肝素分子中常见的重复二糖单元进行降解，而对肝素中与抗凝活性相关的非规则区降解效率较低，所以肝素酶i是研究肝素非规则区结构的有力工具。

14、进一步，所述top-down法的分离时间为70分钟，所述bottom-up法的分离时间为40分钟。

15、进一步，所述流动相a的浓度为0.001-0.01mol/l，优选为0.005mol/l；所述流动相b中乙酸铵溶液的浓度为0.05-0.2mol/l，优选为0.1mol/l。

16、作为优选，所述流动相b中，乙酸铵溶液和乙腈的体积比1：19。

17、作为优选，所述流动相的配制方法如下：

18、1)乙酸铵储备液：精密称取乙酸铵适量，加入适量纯化水，溶解后用0.45μm滤膜过滤，配制成浓度为1mol/l的乙酸铵母液。

19、2)流动相a：移取5ml乙酸铵储备液于1000ml容量瓶中，加纯化水定容，使用之前脱气。

20、3)流动相b：移取5ml乙酸铵储备液于50ml容量瓶中，加纯化水定容后转移至1000ml容量瓶中，加色谱纯乙腈稀释定容，使用之前脱气。

21、进一步，所述top-down法和bottom-up法中，色谱柱为hilic2×150mm；柱温为18℃-25℃，优选为22℃；流速为0.1-0.2ml/min，优选为0.15ml/min。

22、进一步，所述top-down法是样品溶液进样检测。

23、进一步，所述bottom-up法中，样品溶液采用肝素酶i进行酶解处理后进样检测。

24、作为优选，所述肝素酶i的酶活力为0.4iu/ml。

25、进一步，样品溶液浓度为4-6mg/ml，优选为5mg/ml。

26、作为优选，待测样品配制方法如下：

27、1)样品溶液：取那屈肝素钙供试品(如10mg)溶于h2o(如2ml)中，涡旋均匀至完全溶解；

28、2)酶解处理的样品溶液：使用ph 7.0的kh2po4缓冲液溶解肝素酶，使之成0.4iu/ml，涡旋混合；取步骤1)配制的样品溶液(如20μl)，加入ph 7.0的醋酸钙溶液(如70μl)，再加入0.4iu/ml肝素酶溶液(如100μl)，轻轻混匀，在25℃下共同孵育48h；48h后，将上述反应液水浴煮沸5min，然后在8000r/min转速下离心5min，取上清液备用。

29、作为优选，所述bottom-up法中还包括对照溶液的检测，所述对照溶液配制如下：使用ph 7.0的kh2po4缓冲液溶解肝素酶，使之成0.4iu/ml，涡旋混合；取h2o(如20μl)，加入ph 7.0的醋酸钙溶液(如70μl)，再加入0.4iu/ml肝素酶溶液(如100μl)，轻轻混匀，在25℃下共同孵育48h；48h后，将上述反应液水浴煮沸5min，然后在8000r/min转速下离心5min，取上清液备用。

30、进一步，进样量为3μl。

31、本发明的目的之二在于提供一种检测那屈肝素钙中寡糖、寡糖片段含量的方法。

32、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

33、检测那屈肝素钙中寡糖、寡糖片段含量的方法，包括如下步骤：

34、(1)采用前述分离方法分离得到那屈肝素钙的寡糖和/或寡糖片段；

35、(2)采用质谱检测器进行检测，得到总离子流图；

36、(3)根据步骤(2)的检测结果，计算得到单个寡糖组分的含量。

37、进一步，所述质谱检测器为紫外检测器，检测波长为220-250nm，优选为234nm。

38、进一步，质谱条件包括：毛细管电压为2-3kv，锥孔电压为35-45v，离子源温度为110-130℃，脱溶剂温度为450-550℃，锥孔气体流量为45-55l/h，脱溶剂气体流量为500-700l/h，碰撞能量为5.00-7.00ev。

39、作为优选，毛细管电压为2.5kv，锥孔电压为40v，离子源温度为120℃，脱溶剂温度为500℃，锥孔气体流量为50l/h，脱溶剂气体流量为600l/h，碰撞能量为6.00ev。

40、进一步，以单个寡糖组分响应值占总响应值的比例为该寡糖组分或寡糖片段的含量。

41、进一步，根据各组分的保留时间对寡糖组分或寡糖片段进行定性。

42、本发明的目的之三在于提供一种那屈肝素钙质谱库的构建方法。

43、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

44、那屈肝素钙质谱库的构建方法，包括如下步骤：

45、(1)采用前述检测那屈肝素钙中寡糖、寡糖片段含量的方法对那屈肝素钙的寡糖组分和/或酶解后的寡糖片段进行分离和检测；

46、(2)分析步骤(1)的检测结果，构建那屈肝素钙质谱库；

47、所述那屈肝素钙质谱库包括那屈肝素钙全碳链糖谱质谱库、那屈肝素钙肝素酶i酶解后寡糖片段的质谱库中的任一种或多种。

48、进一步，步骤(2)中，使用unifi软件进行分析。

49、作为优选，采用top-down法建立那屈肝素钙全碳链糖谱质谱库，采用bottom-up法建立那屈肝素钙酶解后寡糖片段的质谱库。

50、作为优选，所述top-down法是以空白溶液、供试品溶液顺序进样，记录总离子流图，使用unifi软件提取特定糖链结构的质荷比，精确至小数点后第4位，实际测得质荷比与理论质荷比相对偏差小于30ppm。再从每个组份匹配得到的多个数据中，根据响应值、加合程度、与理论值相对误差以及保留时间综合考虑，选择最优值。以单个寡糖组分响应值占总响应值的比例为该寡糖组分的含量。

51、作为优选，所述bottom-up法是以空白溶液、对照溶液、供试品溶液顺序进样，记录总离子流图，使用unifi软件提取特定糖链结构的质荷比，精确至小数点后第4位，实际测得质荷比与理论质荷比相对偏差小于30ppm。再从每个组份匹配得到的多个数据中，根据响应值、加合程度、与理论值相对误差以及保留时间综合考虑，选择最优值。以单个寡糖组分响应值占总响应值的比例为该寡糖组分的含量。

52、进一步，上述那屈肝素钙质谱库的构建方法同样适用于那屈肝素钙肝素酶ⅱ酶解后寡糖片段的质谱库、那屈肝素钙肝素酶ⅲ酶解后寡糖片段的质谱库的建立。区别在于，bottom-up法中，样品溶液采用肝素酶ⅱ和/或肝素酶ⅲ进行酶解处理后进样检测。

53、本发明的有益效果在于：

54、1.那屈肝素钙的结构异常复杂，结构解析、质量控制等相关的分析策略和方法一直是该领域的难点。多年来，那屈肝素钙结构序列分析在低分子量肝素寡糖组成序列结构分析(top down)和部分酶解寡糖产物序列结构分析(bottom-up)的相关方法方面均相对独特，对仪器设备要求较高，技术难度相对较大。本发明采用超高效液相色谱结合hilic色谱柱对那屈肝素钙有良好分离效果，再结合质谱较好的定性、定量检测能力，应用于那屈肝素钙的组成和序列结构分析中，将助力那屈肝素钙药物安全可控良性发展。

55、2.本发明建立了结构清晰、分子式明确的那屈肝素钙的质谱库，完成了那屈肝素钙糖链的质谱数据检索和归属。同时本发明还建立了那屈肝素钙糖链的检测方法，包括top-down和bottom-up两种方式，该方法具有耗时短、操作简单的特点。

56、3.本发明建立的bottom-up法，使用肝素酶酶解的方式，将那屈肝素钙降解，然后测定降解产物中天然的与修饰的寡糖结构，能够反映出仿制药和原研药的一致性。

57、4.本发明提出的top-down法，可以在70分钟内实现那屈肝素钙中寡糖的分离；本发明提出的bottom-up法可在40分钟内实现那屈肝素钙中寡糖片段的分离。本发明提出的检测方法分离时间短、分离效果好，分离的寡糖类型多。