一种微流控芯片在结肠癌中异质型CTCs捕获与检测中的应用

本发明涉及细胞检测装置，具体是一种微流控芯片在结肠癌中异质型ctcs捕获与检测中的应用。

背景技术：

1、全球结肠癌每年有数百万新发病例，几十万人死亡。结肠癌患者治疗失败和死亡的主要原因是肿瘤转移。其中，从原发部位脱落，进入血液循环的癌细胞被称为循环肿瘤细胞(ctcs)。ctcs的数量能反映肿瘤负荷和检测疗效，且早于标准影像学变化，因而被认为是早期诊断、化疗疗效评估和癌症预后的替代预测指标。然而，ctcs的检测和分析面临两个主要挑战：稀有性和表型异质性。在人类癌细胞系和小鼠模型中，上皮型ctcs在经历emt(上皮-间充质转化)后转化为间质型ctcs，间质型ctcs具有更强的侵袭性。各种癌症患者外周血ctcs数量和emt分型与预后紧密相关。ctcs的稀有性是指在1ml的血液中，存在数以亿计的血细胞，而ctcs的数量只有几十至几百，这使得白细胞对ctcs的检测干扰极大，ctcs的异质性是指ctcs在emt的过程中，上皮特征逐渐消失，肿瘤细胞表面的epcam(上皮细胞黏附分子)表达降低甚至完全消失，造成ctcs的识别和捕获效率降低；因此，高效和灵敏的ctcs富集和检测技术是ctcs临床应用的基础，检测外周血ctc和emt分子分型有助于无创评估癌症患者血源性转移状态，尽早调整治疗方案，改善其预后。

2、近些年来已经发展出了多种高效富集ctcs的方法和策略，主要包括利用ctcs自身生物物理特性的物理分离法和免疫亲和法。通常物理分离法的效率和纯度均较低，而且会对捕获到的ctcs造成机械损伤，从而影响细胞活力。免疫亲和法主要是基于抗体或适配体和ctcs表面高度表达的抗原(目前主要为上皮细胞黏附因子(epcam)和细胞角蛋白)之间的免疫亲和特性进行的富集技术，但该技术也存在一些缺陷，如ctcs抗原表达的异质性，导致在捕获时ctcs容易丢失，造成检测的假阴性。因此，将物理分离和免疫亲和的方法结合起来，能够优势互补，在进一步提高ctcs富集效率和纯度的同时，最大程度的保持细胞高活力。

3、微流控技术是一种用于控制小规模流体的装置和系统的技术，可以将微量样本的生物、化学等实验集成在芯片上，实现微流体操纵。与传统分析装置相比，该技术可以缩短实验时间，降低污染风险，提高自动化效率，拥有更高的灵敏度和可靠性。

技术实现思路

1、发明目的：本发明提供了一种微流控芯片在结肠癌中异质型ctcs捕获与检测中的应用，本发明提供的微流控芯片能够检测外周血ctc和emt分子分型，有助于无创评估癌症患者血源性转移状态，为结肠癌患者的早期诊断及治疗方案调整提供有效的解决思路。

2、技术方案：一种微流控芯片在结肠癌中异质型ctcs捕获与检测中的应用，包括如下步骤：

3、步骤一、制备微流控芯片；

4、所述微流控芯片包括级联设置的螺旋分离芯片和免疫捕获检测芯片；所述螺旋分离芯片包括单螺旋微流控通道，所述单螺旋微流控通道的第一端位于单螺旋微流控通道的内部，所述单螺旋微流控通道的第二端位于单螺旋微流控通道的外部，所述单螺旋微流控通道的第一端设有两个入口，分别是鞘流入口和样品入口，且鞘流入口位于内侧，样品入口位于外侧；所述单螺旋微流控通道的第二端设有两个出口，分别是靶目标出口和废液出口，且靶目标出口位于内侧，废液出口位于外侧；所述免疫捕获检测芯片上设有依次连通的进口通道、第一凹槽、连接通道、第二凹槽、出口通道；所述第一凹槽为上皮型ctcs捕获检测区，第二凹槽为间质型ctcs捕获检测区；第一凹槽内设有nh2-epcam适配体修饰的gel-go水凝胶，第二凹槽内设有nh2-vimentin适配体修饰的gel-go水凝胶；所述螺旋分离芯片的靶目标出口与免疫捕获检测芯片的进口通道连通；

5、步骤二、异质性ctcs的分离；

6、待检测血液样本先进入螺旋分离芯片后，分离得到异质性ctcs；所述异质性ctcs包括上皮型ctcs和间质型ctcs；

7、步骤三、异质性ctcs的捕获；

8、螺旋分离芯片的靶目标出口流出的异质性ctcs，通过免疫捕获检测芯片的进口通道进入免疫捕获检测芯片，待检测血液样本中的上皮型ctcs被第一凹槽捕获，间质型ctcs被第二凹槽捕获；

9、步骤四、异质性ctcs的检测；

10、1)在第一凹槽内滴加sh2-epcam适配体修饰的mptnps溶液，即mptnps/aptepcam溶液，孵育后再加入tmb和h2o2的混合溶液；

11、2)在第二凹槽内滴加sh-vimentin适配体修饰的mptnps的溶液，即mptnps/aptvimentin溶液，孵育后再加入tmb和h2o2的混合溶液；

12、3)利用mptnps催化tmb的显色反应，检测上皮型ctcs捕获检测区与间质型ctcs捕获检测区反应后的吸光度值与细胞数量之间的关系，计算上皮型ctcs和间质型ctcs的数量。

13、进一步的，步骤一中：

14、1)单螺旋微流控通道的通道宽度为350μm，深度为150μm，曲率直径为1cm；

15、2)免疫捕获检测芯片中，进口通道、连接通道、出口通道的宽度和深度均为1mm，第一凹槽和第二凹槽的深度是6mm，底面积0.95cm2。

16、3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤一中，免疫捕获检测芯片上nh2-epcam适配体修饰的gel-go水凝胶和nh2-vimentin适配体修饰的gel-go水凝胶的制备方法如下：

17、步骤1.1)、制备明胶-氧化石墨烯水凝胶；

18、吸取1ml，2mg/ml的氧化石墨烯悬浮液于离心管中，超声使其分散均匀；随后加入15wt％的明胶溶液至5ml，在37℃下，搅拌30min，即得明胶-氧化石墨烯水凝胶，即gel-go水凝胶；gel-go水凝胶中，氧化石墨烯的浓度为0.4mg/ml；

19、步骤1.2)适配体化gel-go水凝胶；

20、将制得的gel-go水凝胶加入到第一凹槽和第二凹槽内，放入4℃冰箱30min，使gel-go水凝胶从溶液状态逐渐变为固态；随后加入4mg/ml edc和6mg/ml nhs混合溶液，室温下反应2h进行羧基的活化，活化完成后，用pbs缓冲溶液对冲洗；

21、在第一凹槽各加入200μl，1.0μm的nh2-epcam适配体，放置在4℃冰箱，孵育12h，孵育完成后pbs缓冲溶液冲洗，得到nh2-epcam适配体修饰的gel-go水凝胶；

22、在第二凹槽内加入200μl，1.0μm的nh2-vimentin适配体，放置在4℃冰箱，低温下孵育12h；孵育完成后用pbs缓冲溶液冲洗，得到nh2-vimentin适配体修饰的gel-go水凝胶。

23、进一步的，步骤二中，待检测血液样本进入螺旋分离芯片的最佳分离流速为样品流速350μl/min，鞘流流速为700μl/min。

24、进一步的，步骤四中，mptnps/aptepcam溶液和mptnps/aptvimentin溶液的制备方法如下：

25、1)、将100.0μl的15.0μm sh-epcam适配体和sh-vimentin适配体分别与2.5μl的1.0m、tcep溶液混合，室温下30min以活化巯基；

26、2)、活化完成后，分别将1.0ml、5mg/ml的mptnps与已活化的sh-epcam适配体和sh2-vimentin适配体涡旋混匀并使适配体终浓度为1.0μm；

27、3)、最后将混合溶液在垂直混悬仪室温反应12h即得到sh-epcam适配体和sh-vimentin适配体修饰的两种mptnps，分别记为mptnps/aptepcam和mptnps/aptvimentin；

28、4)反应结束后，12000转离心15min以去除上清中未结合的适配体，最后重新分散于pbs溶液中，得到mptnps/aptepcam溶液和mptnps/aptvimentin溶液，4℃保存。

29、进一步的，步骤四具体为：

30、1)在第一凹槽内加入mptnps/aptepcam溶液的体积为100μl，mptnps/aptepcam的浓度为20μg/ml；室温下孵育30min后，将多余的mptnps/aptepcam溶液洗掉，并加入200μl，0.5mmtmb和50mm h2o2的混合溶液，孵育10min后加入不含硫酸的tmb反应终止液；

31、2)在第二凹槽内加入mptnps/aptvimentin溶液的100μl，mptnps/aptvimentin浓度为20μg/ml；室温下孵育30min后，将多余的mptnps/apt洗掉，并加入200μl，0.5mm tmb和50mmh2o2的混合溶液，孵育10min后加入不含硫酸的tmb反应终止液；

32、3)上皮型ctcs捕获检测区，反应后的吸光度值与上皮型ctcs细胞数量之间的关系公式如下：

33、y＝0.403lgx-0.063，r2＝0.994；

34、其中，x表示吸光度，y表示细胞数量；

35、4)间质型ctcs捕获检测区，反应后的吸光度值与间质型ctcs细胞数量之间的关系公式如下：

36、y＝0.345lgx-0.014，r2＝0.994；

37、其中，x表示吸光度，y表示细胞数量。

38、有益效果：本发明公开了一种微流控芯片在结肠癌中异质型ctcs捕获与检测中的应用，本发明制备的螺旋分选微流控芯片快速富集异质性ctcs，并在免疫捕获检测芯片上对上皮表达型和间质表达型ctcs细胞进行分批捕获，同时利用两种不同适配体修饰的mptnps探针对其进行快速地检测。与传统ctcs研究方法相比，本发明在保持较高捕获效率的同时，能够对异质性ctcs做出灵敏和特异性的响应，同时捕获后的ctcs仍具有高活性。借助芯片技术，进一步实现了ctcs捕获和检测、鉴别一体化的研究。本发明开拓ctcs在临床的应用提供了一种有力的工具。