一种用于缩小家蚕蛾翅面积的siRNA制备方法和应用

本发明涉及家蚕物质能量代谢与繁殖领域，尤其是涉及了一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna、制备方法及应用。

背景技术：

1、家蚕(bombyx mori)是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，它从桑叶(饲料)中摄取各种营养物质，并通过代谢生理过程供给蚕体内各个组织器官而进行生长、发育、繁殖等。家蚕通过蚕蛾的交配、产卵进行繁殖，蚕蛾翅的大小对其交配、产卵产生一定的影响。

2、神经肽在昆虫的物质能量代谢等重要生理过程调控中发挥重要作用，其发挥作用的信号通路是由调节因子来介导的。昆虫神经肽信号通路的调节因子研究比较滞后，直到2000年才首次在果蝇中发现并被命名为kurtz蛋白。在家蚕中发现神经肽信号通路需要家蚕kurtz(bmkurtz)蛋白参与介导，但有关bmkurtz介导神经肽作用，来调控家蚕生长与物质能量代谢等，均缺乏研究。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种缩小家蚕蛾翅面积的方法，是采用rt-pcr克隆，pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收，与哺乳动物表达载体pflag-cmv-3连接，与t7反应缓冲液、atp液、ctp液、gtp液、utp液、t7酶液混合反应，再给家蚕蛹腹部注射的方法，通过调控家蚕物质能量代谢，缩小家蚕蛾翅面积。

2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一、一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna制备方法，方法步骤为：

4、(1)解剖并收集五龄第2-3天的家蚕脂肪体，从中提取总rna，然后逆转录获得第1链cdna；

5、(2)以所述第1链cdna为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)进行扩增克隆获得家蚕kurtz cdna(bmkurtz cdna)；

6、(3)以所述家蚕kurtz cdna为模板，通过pcr扩增并用琼脂糖凝胶电泳回收得到bmkurtz dna片段，经hindiii/bamhi酶切后，与哺乳动物表达载体pflag-cmv-3连接，获得pflag-bmkurtz；

7、(4)以所述pflag-bmkurtz为模板，通过pcr扩增并用琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的目的pflag-bmkurtz dna片段，作为反应模板；

8、(5)将所述反应模板与10×t7反应缓冲液、atp液、ctp液、gtp液、utp溶液和t7酶混合进行反应，然后再进行后续处理得到bmkurtz sirna，作为所述sirna。

9、所述步骤(1)具体为：解剖并收集五龄第2-3天的家蚕脂肪体，使用triz ol试剂盒从中提取总rna，再用逆转录第1链cdna合成试剂对总rna进行逆转录，获得第1链cdna；逆转录的条件是：65℃变性4min，42℃反应55min，70℃灭活13min。

10、所述步骤(2)具体为：以第1链cdna为模板，分别用如seq id no.1的正向引物和seq id no.2的反向引物进行逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)扩增，克隆获得家蚕kurtzcdna(bmkurtz cdna)；所述的逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)扩增的条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，进行32个循环。

11、所述步骤(3)中，bmkurtz dna片段具体采用以下方式获得：以家蚕ku rtz cdna为模板，分别用seq id no.3的正向引物和seq id no.4的反向引物进行pcr扩增，得到bmkurtz dna片段；所述的pcr扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，加rtaq酶继续延伸16min。

12、所述步骤(4)得到pflag-bmkurtz dna片段所具体采用的方式如下：以pflag-bmkurtz为模板，分别用seq id no.5的特异性引物和seq id no.6的特异性引物进行pcr扩增；所述的pcr扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，得到pflag-bmkurtz dna片段。

13、所述步骤(5)具体为：

14、(5.1)在试管内依次加入1.5-2μg反应模板以及2μl 10×t7反应缓冲液、2μl atp液、2μl ctp液、2μl gtp液、2μl utp液和2μl t7酶液混合物；

15、(5.2)继续补充无核酸酶的双蒸馏水至20μl并充分混合，放置于37℃反应18h，后冷却至常温；

16、(5.3)在步骤(5.2)获得的混合液中加入1μl turbo dna酶，混匀后于37℃下孵育16min；

17、(5.4)再加入30μl无核酸酶的双蒸馏水、30μl 7.5m氯化锂和50mm edta，终止反应；

18、(5.5)于4℃下15000rpm离心16min，除去上清液，加入1ml 70％质量百分比的乙醇溶液洗涤；

19、(5.6)于4℃下15000rpm离心16min，除去70％质量百分比的乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到bmkurtz sirna。

20、二、一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna，采用上述步骤(1)-(5)任一所述制备方法制备而成。

21、三、一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna的应用：

22、上述方法获得的sirna或所述sirna用于缩小家蚕蛾翅面积。

23、四、所述sirna用于缩小家蚕蛾翅面积的方法：

24、将家蚕蛹腹部注射bmkurtz sirna，后置于一定温度和一定湿度且昼明夜暗的环境中保护，化蛾获得翅面积缩小的家蚕蛾。

25、将bmkurtz sirna液过滤膜除菌，后将化蛹第1天的家蚕蛹腹部注射16-22μgbmkurtz sirna，将注射后的蚕蛹置于温度为24-25℃、湿度为70-80％、昼明夜暗的环境中保护，注射后的蚕蛹化蛾获得翅面积缩小的家蚕蛾。

26、通过大量实验证实，在没有改变家蚕遗传特性的情况下，采用本发明技术的化蛾第1天蚕蛾翅面积较对照区未采用本发明技术的化蛾第1天蚕蛾翅面积缩小约28％。

27、本发明具有的有益效果是：

28、本发明缩小家蚕蛾翅面积的方法，是在没有改变家蚕遗传特性的情况下，通过调控家蚕代谢来实现的，这对于研究家蚕的物质与能量代谢机制、进一步提高家蚕生理机能等，具有积极作用。

技术特征：

1.一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna制备方法，其特征在于方法步骤为：

2.根据权利要求1所述的一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：解剖并收集五龄第2-3天的家蚕脂肪体，使用trizol试剂盒从中提取总rna，再用逆转录第1链cdna合成试剂对总rna进行逆转录，获得第1链cdna；逆转录的条件是：65℃变性4min，42℃反应55min，70℃灭活13min。

3.根据权利要求1所述的一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为：以第1链cdna为模板，分别用如seq id no.1的正向引物和seq idno.2的反向引物进行逆转录聚合酶链式反应扩增，克隆获得家蚕kurtz cdna；所述的逆转录聚合酶链式反应扩增的条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，进行32个循环。

4.根据权利要求1所述的一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，bmkurtz dna片段具体采用以下方式获得：以家蚕kurtz cdna为模板，分别用seq id no.3的正向引物和seq id no.4的反向引物进行pcr扩增，得到bmkurtz dna片段；所述的pcr扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，加rtaq酶继续延伸16min。

5.根据权利要求1所述的一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(4)得到pflag-bmkurtz dna片段所具体采用的方式如下：以pflag-bmkurtz为模板，分别用seq id no.5的特异性引物和seqid no.6的特异性引物进行pcr扩增；所述的pcr扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，得到pflag-bmkurtz dna片段。

6.根据权利要求1所述的一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(5)具体为：

7.一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna，其特征在于：采用权利要求1-6任一所述制备方法制备而成。

8.一种用于缩小家蚕蛾翅面积的sirna的应用，其特征在于：权利要求1所述方法获得的sirna或权利要求7所述sirna用于缩小家蚕蛾翅面积。

9.利用权利要求8所述sirna用于缩小家蚕蛾翅面积的方法，其特征在于：将家蚕蛹腹部注射bmkurtz sirna，后置于一定温度和一定湿度且昼明夜暗的环境中保护，化蛾获得翅面积缩小的家蚕蛾。

10.根据权利要求9所述的sirna用于缩小家蚕蛾翅面积的方法，其特征在于：将bmkurtz sirna液过滤膜除菌，后将化蛹第1天的家蚕蛹腹部注射16-22μg bmkurtz sirna，将注射后的蚕蛹置于温度为24-25℃、湿度为70-80％、昼明夜暗的环境中保护，注射后的蚕蛹化蛾获得翅面积缩小的家蚕蛾。

技术总结本发明公开了一种用于缩小家蚕蛾翅面积的siRNA制备方法和应用。提取家蚕脂肪体中总RNA，逆转录获得第1链cDNA；以其为模板进行扩增获得家蚕Kurtz cDNA；以其为模板进行PCR扩增，酶切后将DNA片段连接载体获得pFLAG‑BmKurtz；以其为模板进行PCR扩增获得反应模板；将反应模板与混合溶液混合反应并进一步处理，得到BmKurtz siRNA；将BmKurtz siRNA注射入化蛹的家蚕蛹腹部，化蛾后的蚕蛾翅面积缩小。本发明通过调控家蚕代谢实现，没有改变家蚕遗传特性，极大地促进了家蚕的物质与能量代谢机制、调控家蚕生理机能等研究。技术研发人员：时连根,刘雪受保护的技术使用者：浙江大学技术研发日：技术公布日：2024/12/23