一种直接利用废弃二氧化碳产3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用

本发明涉及一种直接利用废弃二氧化碳产3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用，并公开了其生物合成关键基因的核苷酸序列，属于基因工程。

背景技术：

1、3-羟基丙酸是一种多功能平台化学品，是1,3-丙二醇、3- 羟基丙醛、丙烯酸和丙二酸等多种化工原料的重要前体，并可用于合成多种生物可降解聚合材料。3-羟基丙酸分子中的羟基和羧基可以聚合形成聚 (3-羟基丙酸酯)[p(3hp]，[p(3hp)]也是一种具有生物兼容性、高机械强度和拉伸强度的可生物降解材料，应用广泛。此外，3-羟基丙酸还可以用于合成医用骨骼和塑料产品，在医药和化工领域具有重要的应用前景。

2、目前，3-羟基丙酸的生产以化学合成为主，主要以丙烯酸、乙烯酮、3-羟基丙腈、醋酸乙烯酯和1, 3-丙二醇为前体物质，通过一系列化工路线进行转化。化学法合成 3-羟基丙酸的操作相对简单，反应条件温和，且产率较为稳定，但化学合成法也具有环境污染大、能耗高、产物分离过程复杂、副产物繁多等缺点，限制了其进一步产业化应用。生物法合成3-羟基丙酸则可以有效避免这些不利因素。生物转化法合成3-羟基丙酸的相关研究起步于近二十年，主要是利用重组大肠杆菌和酿酒酵母等异养生物以甘油或葡萄糖等有机化合物为底物进行微生物转化，研究主要集中于工程菌的构建优化和发酵工艺的改进，以期有效提高3-羟基丙酸产量。

3、然而截止目前为止，尚未有通过嗜热自养蓝细菌进行3-羟基丙酸生产的相关报道。该重组菌株不仅能直接进行废气二氧化碳的资源化，而且还可以利用废气二氧化碳所携带的余热对嗜热菌株进行培养，实现真正意义的节能减排。与此同时，在高温环境下进行二氧化碳的直接利用，还可以降低废气二氧化碳的冷却成本。此外，对于工程菌株发酵培养而言，耐高温的嗜热菌株更不容易被其他杂质污染，有利于进一步降低发酵生产成本。因此，本发明利用本研究团队前期自主分离的嗜热蓝细菌e542作为宿主菌株，将编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和编码丙二酸半醛还原酶基因msr整合到穿梭的游离质粒prs416-kana上，并将重组质粒导入构建重组嗜热蓝细菌e542，通过发酵培养检测在高温环境下重组嗜热蓝细菌e542生物合成3-羟基丙酸的水平。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种直接利用废弃二氧化碳产3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用，并公开了其生物合成关键基因的核苷酸序列，具体技术方案如下：

2、一种直接利用废气二氧化碳产3-羟基丙酸的重组菌，所述重组菌是将编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和编码丙二酸半醛还原酶基因msr通过穿梭质粒prs416-kana导入嗜热蓝细菌e542中获得的；基于嗜热蓝细菌e542对所述编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和编码丙二酸半醛还原酶基因msr进行了密码子偏好性优化，所述mcr经过密码子优化后的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述msr经过密码子优化后的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、在本发明的一个实施例中，所述编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和编码丙二酸半醛还原酶基因msr均来源于嗜热金属球菌 metallosphaera sedula。

4、在本发明的一个实施例中，丙二酰-coa还原酶在ncbi的蛋白质编号是a4yen2.1；丙二酸半醛还原酶在ncbi的蛋白质编号是abp96133.1。

5、本发明还提供了上述重组菌的构建方法，步骤如下：

6、1）分别合成编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和丙二酸半醛还原酶基因msr。

7、选择启动子pcpcb17942，其核苷酸序列seq id no.3；选择终止子trrnbt1，其核苷酸序列seq id no.4；通过pcr融合获得丙二酰-coa还原酶基因mcr的表达框，其核苷酸序列seq id no.5。

8、选择启动子pcpc5606803，其核苷酸序列seq id no.6；选择终止子trbcl6803，其核苷酸序列seq id no.7；通过pcr融合获得丙二酸半醛还原酶基因msr的表达框，其核苷酸序列seq id no.8。

9、通过gibson组装方式将两个基因的表达框构建到质粒prs416-kana上，并通过转入大肠杆菌dh5a感受态细胞中进行筛选，获得重组载体prs416-kana-pcpcb17942-mcr-trrnbt1-pcpc5606803-msr-trbcl6803。空质粒和重组质粒的核苷酸序列分别是seq id no.9与seq id no.10。

10、2）将步骤1）获得的重组载体，转化到嗜热蓝细菌e542中，并通过卡那霉素的抗性筛选获得重组嗜热蓝细菌e542。由于pcpcb17942与pcpc5606803都是蓝细菌组成型启动子，因此mcr和msr可以在发酵培养的过程中直接进行转录和翻译。

11、本发明还提供了上述重组菌在发酵生产3-羟基丙酸中的应用。

12、在本发明的一个实施例中，所述生产3-羟基丙酸的方法，步骤如下：

13、1）活化重组嗜热蓝细菌e542，获得种子菌液；

14、2）将步骤1）所得的种子液接到含有卡纳霉素的bg11培养基中进行培养5-10天。

15、在本发明的一个实施例中，步骤2）的培养条件是55℃，220rpm，300μmol photons/m2/s。

16、在本发明的一个实施例中，步骤2)中所述种子液按体积比为2%的接种量接种到含终浓度为30ug/ml卡纳霉素的bg11培养基中，并于55℃，220rpm，300μmol photons/m2/s的条件下振荡培养5-10天后终止发酵。

技术特征：

1. 一种直接利用废弃二氧化碳产3-羟基丙酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和编码丙二酸半醛还原酶基因msr通过穿梭质粒prs416-kana导入嗜热蓝细菌e542中获得的；基于嗜热蓝细菌e542对所述编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和编码丙二酸半醛还原酶基因msr进行了密码子偏好性优化，所述mcr经过密码子优化后的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述msr经过密码子优化后的核苷酸序列如seq idno.2所示。

2. 一种权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述编码丙二酰-coa还原酶基因mcr和编码丙二酸半醛还原酶基因msr均来源于嗜热金属球菌metallosphaera sedula。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，丙二酰-coa还原酶在ncbi的蛋白质编号是a4yen2.1；丙二酸半醛还原酶在ncbi的蛋白质编号是abp96133.1。

4.一种权利要求1-3任意一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

5.一种权利要求1-3任意一项所述的重组菌在发酵生产3-羟基丙酸过程中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生产3-羟基丙酸的方法，步骤如下：

技术总结本发明提供了一种直接利用废弃二氧化碳产3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用,并公开了针对嗜热蓝细菌E542进行密码子优化后的编码丙二酰‑CoA还原酶基因MCR和编码丙二酸半醛还原酶基因MSR的核苷酸序列，属于基因工程技术领域。针对3‑羟基丙酸的生物合成，本发明提供了一种直接利用废弃二氧化碳为原料进行生物合成3‑羟基丙酸的重组嗜热蓝细菌，该菌株是将编码丙二酰‑CoA还原酶基因MCR与丙二酸半醛还原酶基因MSR通过游离的穿梭质粒导入嗜热蓝细菌E542中获得。本发明制备的重组嗜热蓝细菌实现了直接利用废弃二氧化碳为原料生物合成3‑羟基丙酸，该方法生产安全、环境友好、成本低且可持续，为3‑羟基丙酸进一步绿色可再生生产提供了新的思路。技术研发人员：尤大伟,毛睿慈受保护的技术使用者：北京大学深圳研究生院技术研发日：技术公布日：2024/6/13