一种多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统及其制备方法

本发明涉及纳米药物递送，特别是涉及一种多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统及其制备方法。

背景技术：

1、在临床癌症治疗过程中，目前主要存在三种方法即手术治疗、放射治疗以及化学药物治疗(简称化疗)，但是这几种方法都存在各自的缺陷。如手术治疗存在风险高、创伤大及易产生并发症等缺陷。放射治疗由于缺乏肿瘤特异性，放射线在杀死肿瘤细胞的同时不可避免的会影响到正常组织，引起机体免疫功能减退。化疗是一种全身治疗方法，因其简便易行，效果显著，是目前治疗癌症最有效的方法之一。而化疗属于非靶向机制，不能选择性的到达肿瘤细胞，所以在杀死肿瘤细胞的同时，也会损伤正常的组织细胞。此外，化疗法还存在药物利用率低，多次给药易产生“耐药性”等缺点，会进一步加深癌症治疗的困难程度，此外许多药物(特别是治疗癌症的药物)具有细胞毒性，在消灭病灶细胞的同时对正常细胞损伤也很严重。

2、理想的可控药物传输系统不仅应具有良好的生物相容性、较高的载药率和包封率、良好的细胞或组织特异性--即靶向性；还应具有在达到目标病灶部位之前不释放药物分子，到达病灶部位后才以适当的速度释放出药物分子的特性。纳米载药系统可以避免药物递送到目标组织前的提前释放，因而可以大大提高纳米药物的利用效率，并降低药物对正常细胞的潜在毒副作用。目前以生物可降解高分子纳米材料为载体的控制释放系统往往通过载体结构的水解来达到释放的目标，但高分子材料在水中极不稳定，很难避免提前释放，且在药物装载过程使用的有机溶剂有时会造成包被分子发生不必要的结构和功能的改变，因此，效果并不是很理想。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明的技术方案之一：一种多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统，包括以下原料：作为“门卫”的巯基功能化金纳米球和负载药物的多功能化的核壳介孔硅纳米粒子；

4、所述药物包括核酸药物、多肽类小分子药物或化疗药物；

5、所述多功能包括载药功能和响应刺激功能。

6、进一步地，所述巯基功能化金纳米球的粒径为5～10nm；

7、更进一步地，所述多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统的粒径为50～250nm。

8、所述负载药物的多功能化的核壳介孔硅纳米粒子的粒径为50～200nm，比表面积为300～1000m2/g，平均孔径为1～10nm；

9、所述巯基功能化金纳米球和负载药物的多功能化的核壳介孔硅纳米粒子的质量比为(5～20):1。

10、本发明的技术方案之二：一种上述的多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：

11、将巯基功能化金纳米球通过共价交联的方式加载于负载药物的多功能化的核壳介孔硅纳米粒子表面，得到所述多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统(x@msns-ss-au，x代表药物)。

12、进一步地，所述巯基功能化金纳米球的制备方法，包括以下步骤：

13、采用鞣酸/柠檬酸钠法制备得到含有金纳米球的溶液；

14、在含有金纳米球的溶液中加入l-谷胱甘肽(过量)，搅拌反应后得到所述巯基功能化金纳米球。

15、更进一步地，所述巯基功能化金纳米球的制备方法，包括以下步骤：

16、将haucl4在水中溶解后预热至60～70℃，得到溶液a；将柠檬酸钠溶液和单宁酸、k2co3溶液混合，预热至60～70℃，得到溶液b；将溶液a和溶液b迅速混合并充分混匀，加热至沸腾并保温10min，自然冷却后加入l-谷胱甘肽(过量)，搅拌反应0.5～3h后离心(转速为1000～8000rpm，时间为10～30min)，得到巯基功能化金纳米球(aunps-sh)。

17、进一步地，所述负载药物的多功能化的核壳介孔硅纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

18、(1)将无机碱、溶胀剂和模板剂加热混合均匀(50～80℃)，得到溶液1；

19、在有机碱中加入氨基硅烷，加热混匀(50～70℃，1h)得到溶液2；

20、将溶液2(强烈搅拌，800～1000rpm)加入溶液1中，混合均匀，加热搅拌(0.1～1h)后滴加硅源(滴加速度为10～30d/min)，滴加完成后搅拌30min，待溶液颜色转变为乳白色后得到核层，然后加入壳层材料(巯基硅烷和硅源的混合溶液)，继续反应2h，最后通过萃取冷凝的方式去除模板剂，得到多功能化的核壳介孔硅纳米粒子；

21、更进一步地，所述模板剂的去除方法，包括以下步骤：将萃取反应后获得的物质离心(转速为10000～12500rpm，时间为30min)、洗涤、干燥后分散在无水乙醇中，然后加入浓度为12mol/l的盐酸溶液，加热回流(温度30～70℃，优选为50℃；转速为100～800rpm；时间为12～50h)，反应结束后离心(转速为10000～12500rpm，时间为30min)、洗涤、干燥；所述无水乙醇和盐酸溶液的体积比为9:1。

22、(2)将多功能化的核壳介孔硅纳米粒子分散在溶剂中，然后加入二硫键交联剂，剧烈搅拌反应(1000～8000rpm，10～50h)，离心(转速为10000～12500rpm，时间为30min)、洗涤、干燥，得到二硫键交联的介孔硅纳米粒子；

23、(3)将药物溶液和二硫键交联的介孔硅纳米粒子混合后水浴超声处理5min，然后在室温、避光的条件下剧烈搅拌反应24h，完成二硫键交联的介孔硅纳米粒子对药物的装载，得到所述负载药物的多功能化的核壳介孔硅纳米粒子。

24、进一步地，步骤(1)中，所述无机碱包括氢氧化钠；所述溶胀剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)；所述模板剂包括十六烷基三甲基溴化铵(ctab)；

25、所述有机碱包括三乙醇胺(teoa)；所述硅源包括原硅酸四乙酯(teos)；所述氨基硅烷包括氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)、氨丙基三甲氧基硅烷、n-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷、(环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷中的一种或多种；

26、所述巯基硅烷包括3-巯丙基三乙氧基硅烷(mptms)；

27、步骤(2)中，所述二硫键交联剂为2-(吡啶基二磺基)乙胺(pdea)。

28、进一步地，步骤(1)中，所述模板剂、有机碱和总的硅源的摩尔比为2.08：97：9.35；

29、所述氨基硅烷的用量为总的硅源用量的9.20mol％；所述巯基硅烷的用量为总的硅源用量的0.11～2mol％；

30、所述加入巯基硅烷和硅源的混合溶液，继续反应2h的步骤在惰性气氛下进行；

31、进一步地，所述共价交联采用的活化剂包括质量比为2:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)。

32、更进一步地，当所述药物为核酸药物kras(21bp)时，二硫键交联的介孔硅纳米粒子中的氮和核酸药物中的磷的摩尔比为25:1。

33、本发明的技术方案之三：一种上述多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统在控缓释药物制备中的应用。

34、更进一步地，所述控缓释药物包括用于肿瘤治疗的控缓释药物。肿瘤细胞内、外环境具有电位差异，导致肿瘤组织内存在一定的还原性，这也为纳米药物递送系统的刺激响应性药物释放行为提供了一种可靠的刺激源。细胞内外还原环境的差异主要是因为细胞内某些巯基物质的存在，例如nadph/nadp+、硫蛋白和谷胱甘肽等。经研究发现，肿瘤细胞内谷胱甘肽(glutathione，gsh)的浓度约为1～10mm，是正常细胞(约2～20μm)的10～100倍。因此，可以利用还原性敏感的二硫键作为桥梁，与“阀门”连接起来构建成具有还原响应的智能药物控释系统，含二硫键的纳米载体在血液中流动时，可保持相对稳定性，进入到肿瘤细胞内，被肿瘤细胞质内高浓度的gsh还原成巯基，二硫键被打断，导致“门卫”分子释放，封装在孔道内部药物靶向释放到肿瘤细胞内，从而实现药物在到达靶向部位前的“零释放”。

35、二氧化硅(sio2)是地球上最丰富的天然矿物质之一，也是人类皮肤、骨、毛发和指甲等关键组成部分，被广泛用于食品添加剂、化妆品和药物中。基于sio2的纳米材料在生物医学研究方面最重要的应用之一就是介孔二氧化硅(msns)，其具有高度有序的孔道结构、良好的生物相容性、大的比表面积、细胞靶向性、精准响应性控制释放和到达目标位点前有效阻止药物释放等功能特性，是作为纳米药物载体的良好材料。其上的孔洞可以相对容易地通过物理或化学方法吸附药物，与此同时，二氧化硅的孔径尺寸允许使用大分子来堵塞介孔入口。因而，施加一定的刺激后，这些封盖剂会从孔隙入口脱落，从而触发药物的可控释放。通过以纳米颗粒作为“阀门”对负载药物的介孔二氧化硅进行包覆及表面修饰，获得了氨基和巯基功能化还原性敏感的x@msns-ss-au(多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统)。x@msns-ss-au的粒径约50～250nm，金纳米球和介孔硅壳层的尺寸都可调，具有良好的tem形貌和单分散性(见多功能化的核壳介孔硅纳米粒子的电镜图)，既保留了金纳米粒子的超高摩尔吸光系数、高荧光猝灭效率、光热特性等优点，又成功移植了介孔二氧化硅的良好生物相容性和具有巨大存储能力的孔道结构。

36、本发明公开了以下技术效果：

37、(1)本发明的多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统具有良好的tem形貌和单分散性，超高摩尔吸光系数、光热特性等优点，同时还具有良好生物相容性和巨大存储能力的孔道结构。

38、本发明的多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统中作为“门卫”的巯基功能化金纳米球封装载药介孔二氧化硅纳米载体的孔道并可以进行还原性敏感响应。

39、(2)本发明的多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统具有环境刺激响应(环境响应的基团为二硫键交联基团)和智能载药释药(载药纳米粒子为壳层被巯基修饰，并连接有二硫键交联基团的负载药物的多功能化的核壳介孔硅纳米粒子)的功能。

40、本发明的多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统是一种通过对介孔硅核层、壳层的不同功能化的修饰，并以氧化-还原敏感的二硫键连接金纳米球作为“开关机制”(巯基功能化的金纳米球通过还原性敏感的二硫键与其外部壳层相连，并作为“纳米阀门”封闭介孔硅载药孔道)的药物递送系统，该药物递送系统进入癌细胞后，在高浓度的还原性物质作用下，二硫键断开，作为“门卫”的金帽脱离，释放药物，最终实现药物系统在癌组织部位“被动靶向”富集并智能受控释放，药物利用率高，毒副作用小。

41、(3)本发明的多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统(x@msns-ss-au颗粒)与其他基于sio2的硅晶材料相比，百纳米尺寸下具有有序的孔道结构，优良的生物相容性、大的比表面积，可调的孔径尺寸，易于进行表面功能化等优越的性质，并且可以装载多种小分子药物、蛋白质、核酸分子等，以介孔二氧化硅为主体的刺激响应型纳米载药平台具有很好的“被动靶向”的能力。

42、(4)本发明克服了以往介孔硅纳米载体只能进行单一修饰的局限，通过进行多功能化修饰(巯基、氨基)，即内部进行阳离子化修饰(氨基)，以便通过物理或化学手段载药，外部壳层可以根据具体需求进行不同的刺激响应修饰，为后续生物医疗应用提供了多功能复合纳米粒子的修饰制备手段，进一步拓宽了介孔二氧化硅的生物应用。

43、(5)本发明以kras小分子核酸药物作为模型药物所合成的多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统的载药量高达88.9％，生物利用度高。

44、(6)本发明基于二硫键对还原性环境敏感特性，将巯基修饰后的金纳米球作为“阀门”材料连接在多功能化的核壳介孔硅纳米粒子的表面，在纳米材料上进行巯基修饰，易于操作，修饰效率高。

45、本发明的金纳米球通过鞣酸/柠檬酸钠法制备，解决了nabh4还原法爆炸性成核带来的纳米金球尺寸不可控的问题。巯基功能化金纳米球上的巯基在二硫键交联剂的作用下形成的二硫键具备还原性敏感性，进入体内后，正常的细胞组织不会引起二硫键断裂，进而保证药物在血管内的可靠递送，当递送平台进入肿瘤区域后，在高浓度还原性物质刺激的作用下，二硫键断裂，“门卫”金纳米球脱落，开关机制打开，从而释放药物，能实现对肿瘤细胞的被动靶向富集及智能给药，解决了传统共载药物载体的缺陷。

46、(7)本发明多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统在肿瘤靶向治疗方面，表现出良好的应用前景和经济价值。与以往传统的纳米药物载体相比，多功能化核壳金门控介孔硅纳米粒子药物递送系统具有“肿瘤引发靶向”的能力(通过肿瘤还原性微环境“被动靶向”的方式富集在肿瘤部位，此时二硫键断裂，金纳米帽脱落，开关机制打开，释放出抑制肿瘤生长的药物，达到降低体内毒性，提高生物安全性，显著抑制肿瘤生长的效果，从而实现对癌症的精确靶向治疗，实现有效的癌症诊疗一体化)。