纯化具有IGGFC结构域的融合蛋白的方法与流程

本发明涉及：一种纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法，其中将含有具有iggfc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤以获得内毒素＜0.05eu/mg或尺寸排阻hplc纯度为98％或更高的具有igg fc结构域的融合蛋白；一种纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法，该方法包括：a)培养产生具有igg fc结构域的融合蛋白的细胞，b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质，c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质，d)通过多模态色谱(multimodal chromatography)和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质，其中不使用阴离子交换色谱；通过该方法纯化的具有igg fc结构域的融合蛋白；以及含有所述融合蛋白的组合物。

背景技术：

1、人免疫球蛋白g(igg)的fc结构域是通过与发挥蛋白质功能的结构域融合而在蛋白质药物中显示持续性的因子。因此目前市售的许多蛋白质药物都是以fc融合蛋白的形式开发的。

2、血管内皮生长因子(vegf)是增加血管生成和血管通透性的重要因子。特别地，vegf在肿瘤中过度表达，异常促进血管生成和肿瘤增殖(oncogene((2004))23，1745-1753)。据报道，除了肿瘤发生外，异常血管生成还与其他疾病有重要关系。vegf相关机制中的异常血管生成与湿性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞性黄斑水肿等眼科疾病有关(j.korean med.assoc.(2014),57(7),614-623)。

3、对于眼科疾病的治疗，使用哌加他尼(pegaptanib)(rna适配体)、雷珠单抗(ranibizumab)(单克隆igg抗体片段(fab))、贝伐单抗(bevacizumab)(单克隆igg抗体)，而阿柏西普(aflibercept)(vegfr1和vegfr2与igg1 fc融合)于2011年在美国获批作为湿性黄斑变性治疗药物(biol.ther.(2012)2(3)1-22,drug design,development and therapy(2013)3(7),711-722)。

4、技术问题

5、本发明人开发了通过进行多模态色谱纯化步骤来纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的有效方法。

6、技术方案

7、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法，其中对含有具有igg fc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤，以获得内毒素＜0.05eu/mg或尺寸排阻hplc纯度为98％或更高的具有igg fc结构域的融合蛋白。

8、根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法，所述方法包括：a)培养产生具有igg fc结构域的融合蛋白的细胞；b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质；c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质；d)通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质，其中不使用阴离子交换色谱。根据本发明的又一个方面，本发明提供了通过上述方法纯化的具有igg fc结构域的融合蛋白以及含有该融合蛋白的组合物。

9、有益效果

10、使用本发明的纯化方法可以提供具有igg fc结构域的融合蛋白的有效的大规模生产方法和供应。

技术实现思路

技术特征：

1.一种纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法，其中对含有具有igg fc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤，以获得内毒素＜0.05eu/mg或尺寸排阻hplc纯度为98％或更高的具有igg fc结构域的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中添加了阳离子交换色谱纯化步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中不进行尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换树脂色谱。

4.根据权利要求1所述的方法，其中多模态色谱的配体包括具有离子结合、氢键结合和疏水结合的多模态功能的物质。

5.根据权利要求2所述的方法，其中阳离子交换色谱的配体包括磺酸(-so3)、磺丙基和羧甲基中的至少一种。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在色谱纯化步骤中，采用ph梯度进行洗脱。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中色谱包括洗脱阶段，并且洗脱阶段以结合和洗脱模式进行。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中具有igg fc结构域的融合蛋白是血管内皮细胞生长因子拮抗剂。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中具有igg fc结构域的融合蛋白是阿柏西普。

10.一种纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法，所述方法包括：

11.根据权利要求10所述的方法，其中通过所述方法最终纯化的具有igg fc结构域的融合蛋白的的尺寸排阻hplc纯度为98％或更高，内毒素＜0.05eu/mg，或pi范围为6.0-8.0。

12.根据权利要求10所述的方法，其中具有igg fc结构域的融合蛋白是血管内皮细胞生长因子拮抗剂。

13.根据权利要求10所述的方法，其中具有igg fc结构域的融合蛋白是阿柏西普。

14.根据权利要求10所述的方法，其中步骤d)中通过多模态色谱纯化包括：

15.根据权利要求10所述的方法，其中多模态色谱的配体包括具有离子结合、氢键结合和疏水结合的多模态功能的物质。

16.根据权利要求10所述的方法，其中步骤d)中通过阳离子交换色谱纯化包括：

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤(b)中，ph高于步骤(a)中缓冲液ph的缓冲液的ph范围为5-8。

18.根据权利要求10所述的方法，其中阳离子交换色谱的配体包括磺酸(-so3)、磺丙基和羧甲基中的至少一种。

19.根据权利要求10所述的方法，其中多模态色谱和阳离子交换色谱中的至少一个包括洗脱阶段，并且洗脱阶段以结合和洗脱模式进行。

20.根据权利要求10所述的方法，其中不进行尺寸排阻色谱和疏水相互作用色谱。

21.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤c)和d)中的至少一个之前、之后、或之前和之后的组合，还另外进行深层过滤步骤、超滤步骤、透析过滤步骤和病毒灭活步骤中的至少一个。

22.根据权利要求10所述的方法，其中选自c)通过初级色谱纯化和d)通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化的至少一个步骤包括洗脱阶段，并且所述洗脱阶段采用ph梯度。

23.一种组合物，其包含通过权利要求1或10的方法纯化的具有igg fc结构域的融合蛋白。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中在进行疏水相互作用色谱法分析时，所述组合物包含在下述区段洗脱而获得的峰1级分：流动相a含有50mm磷酸钠、2m氯化钠且ph为7.0，以及流动相b含有50mm磷酸钠、30％乙腈且ph为7.0，其中流动相b的比例为40-45％。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含5％或更少的峰1级分。

技术总结本发明涉及：一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，包括对含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤，从而得到内毒素小于0.05EU/mg或尺寸排阻HPLC纯度为98％以上的具有IgG Fc结构域的融合蛋白；一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，该方法不使用阴离子交换色谱，包括下列步骤：a)培养用于产生具有IgG Fc结构域的融合蛋白的细胞，b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质，c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质，和d)通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质；以及包含通过该方法纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白的组合物。技术研发人员：朴淳宰,卞敏洙,南基硕受保护的技术使用者：阿特根公司技术研发日：技术公布日：2024/8/1