使用内部定量标准物定量核酸序列的组合物、试剂盒和方法与流程

本发明涉及用于定量来自样品的靶核酸的组合物、试剂盒和方法。特别地，本文所述的实施方案使得能够在与靶核酸序列相同的反应体积内使用内部定量标准物(iqs)来定量靶核酸。

背景技术：

1、检测感兴趣的靶核酸序列的测定广泛用于分子生物学和医学，特别是聚合酶链式反应(pcr)过程。临床应用通常涉及从受试者收集样品，提取核酸，并且在靶标特异性引物的存在下使提取的样品经受扩增条件。因此，扩增产物的存在表明靶核酸存在于样品中，而未能测量到扩增产物则表明靶核酸不存在或以对于检测而言太低的水平存在。因此，此类测定可用于检测和监测病原性疾病，以及其他应用(诸如环境样品的分析)。

2、标准定量聚合酶链式反应(qpcr)过程通过监测与靶序列的扩增相关的靶标特异性荧光信号来测量靶dna的扩增。输出是定量循环(cq)值，其指示对应于靶序列的荧光信号超过背景荧光阈值水平的pcr循环数。cq值与样品中的靶核酸的量成反比。即，较低的cq值表示较高量的靶核酸，而较高的cq值表示较低量的靶核酸(或pcr过程的问题)。然而，cq值不直接指示样品中靶核酸的实际浓度。

3、有时通过生成将cq值与靶核酸浓度相关的标准曲线来实现确定测试样品中的靶核酸的量。通过扩增一系列已知浓度的靶核酸并测量所得cq值来生成标准曲线。尽管在一些应用中是有益的，但生成标准曲线需要进行若干独立的反应。这降低了产量，因为附加的反应体积(例如，孔板中的孔)必须专用于标准曲线样品，并且需要附加的操作员时间以及附加的设备和试剂使用。此外，标准曲线不能容易地解释反应之间的“孔对孔”(即，反应体积特异性)可变性。此外，因为标准曲线通常是通过形成已知靶序列的系列稀释液而生成的，所以标准曲线可能固有地包含在系列稀释过程中引入的稀释误差。

4、因此，存在对定量来自样品的靶核酸的系统、方法、试剂盒和其他实施方案的持续需要。

技术实现思路

技术特征：

1.一种用于定量测试样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是病毒核酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述靶核酸是sars-cov-2核酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶标特异性引物对sars-cov-2的orf1a基因、orf1b基因、n基因或s基因中的一者或多者的至少一部分有特异性。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述靶核酸来自人免疫缺陷病毒(hiv)。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述靶标特异性引物对hiv的gag区域、ltr区域、整合酶区域或pol区域中的一者或多者的至少一部分有特异性。

7.根据权利要求1的所述方法，其中所述iqs是外源核酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述iqs是合成核酸。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性引物和所述iqs特异性引物不同，使得所述靶核酸的扩增与所述iqs的扩增是非竞争性的。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性引物中的至少一个靶标特异性引物与所述iqs特异性引物中的至少一个iqs特异性引物相同。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶标特异性引物和所述iqs特异性引物是相同的。

12.根据权利要求10所述的方法，还包括使用被配置为与所述靶核酸的扩增子相关的靶标特异性探针和被配置为与所述iqs的扩增子相关的iqs特异性探针，其中所述靶标特异性探针和所述iqs特异性探针是不同的。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶标特异性探针和所述iqs特异性探针具有不同的序列。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶标特异性探针和所述iqs特异性探针具有共享约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个碱基的重叠序列区域。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶标特异性探针和所述iqs特异性探针具有不同的染料标记。

16.根据权利要求1所述的方法，其中扩增所述靶核酸的至少一部分的步骤包括逆转录反应。

17.根据权利要求1所述的方法，其中扩增所述iqs的至少一部分的步骤包括逆转录反应。

18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)和步骤(d)的所述扩增同时进行。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在不使用标准曲线来确定所述测试样品中的所述靶核酸的所述量的情况下进行。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在不使用被动参考对照染料的情况下进行。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述rq值被确定为：

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述rq值被确定为：

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述校正因子通过以下步骤确定：

24.根据权利要求23所述的方法，其中通过测量多个已知浓度下所述靶标和iqs的多个cq值来确定所述校正因子。

25.根据权利要求24所述的方法，其中通过对所述多个已知浓度的所述cq值比率求平均值来确定所述校正因子。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的所述量(靶标量)通过下式确定：

27.根据权利要求1所述的方法，还包括从原始样品中提取所述靶核酸以形成所述测试样品。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述iqs在所述提取之前添加到所述原始样品。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述iqs是装甲的。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述iqs是装甲的，任选地其中所述iqs是使用ms2外壳蛋白装甲的并且/或者是具有噬菌体ms2载体作为装甲rna的哺乳动物rna病毒载体。

31.根据权利要求1所述的方法，还包括：

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述内源核酸是核糖核酸酶p(rnasep)，并且其中所述内源序列引物对rnasep有特异性。

33.根据权利要求31所述的方法，还包括：

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述靶核酸的扩增效率与所述iqs和/或内源核酸的扩增效率相差不超过约50％、不超过约45％、不超过约40％、不超过约35％、不超过约30％、不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。

35.根据权利要求31所述的方法，其中所述靶核酸的扩增的cq曲线图和所述iqs和/或内源核酸的扩增的cq曲线图的斜率(cq/量)相差不超过约50％、不超过约45％、不超过约40％、不超过约35％、不超过约30％、不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。

36.根据权利要求1所述的方法，其中所述iqs包括：

37.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样品是血液样品。

38.一种用于扩增靶核酸的组合物，所述组合物包含：

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述靶标特异性引物和所述iqs特异性引物是不同的，并且由此使得能够非竞争性扩增所述靶核酸和所述iqs。

40.根据权利要求39所述的组合物，所述组合物用于在根据权利要求1至9或16至37中任一项所述的方法中使用。

41.根据权利要求38所述的组合物，其中所述靶标特异性引物和所述iqs特异性引物具有至少一个共同的引物，从而使得能够竞争性扩增所述靶核酸和所述iqs。

42.根据权利要求41所述的组合物，所述组合物用于在根据权利要求1至8或10至37中任一项所述的方法中使用。

43.根据权利要求42所述的组合物，还包含靶核酸探针和不同的iqs探针。

44.根据权利要求36所述的组合物，其中所述iqs包括：

45.根据权利要求38所述的组合物，其中所述组合物还包含逆转录酶。

46.根据权利要求38的所述组合物，其中所述iqs是外源序列。

47.根据权利要求38所述的组合物，其中所述iqs是合成序列。

48.根据权利要求38所述的组合物，其中所述靶标特异性引物对病毒核酸有特异性。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述靶标特异性引物对sars-cov-2核酸有特异性。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述靶标特异性引物对sars-cov-2的orf1a基因、orf1b基因、n基因或s基因中的一者或多者的至少一部分有特异性。

51.根据权利要求48所述的组合物，其中所述靶标特异性引物对hiv核酸有特异性。

52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述靶标特异性引物对hiv的gag区域、ltr区域、整合酶区域或pol区域中的一者或多者的至少一部分有特异性。

53.根据权利要求38所述的组合物，其中所述iqs对所述靶核酸在cq曲线图中具有可比较的线性度。

54.根据权利要求38所述的组合物，还包含一对内源序列引物，所述一对内源序列引物被配置为使得能够扩增内源序列。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述内源序列引物被配置为使得能够扩增rnasep。

56.根据权利要求38所述的组合物，其中所述靶核酸的扩增效率与所述iqs和/或内源核酸的扩增效率相差不超过约50％、不超过约45％、不超过约40％、不超过约35％、不超过约30％、不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。

57.根据权利要求38所述的组合物，其中所述靶核酸的扩增的cq曲线图和所述iqs和/或内源核酸的扩增的cq曲线图的斜率(cq/量)相差不超过约50％、不超过约45％、不超过约40％、不超过约35％、不超过约30％、不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。

技术总结公开了用于扩增和定量来自样品的靶核酸的组合物、试剂盒和方法。组合物、试剂盒和方法使得能够使用布置在与该靶核酸相同的反应体积中的内部定量标准物来定量来自样品的靶核酸，从而消除对附加的扩增反应和加工以生成标准曲线的需要。组合物、试剂盒和方法还使得能够通过根据每个测试样品中的内源核酸的相对水平归一化每个样品中的该靶核酸的测量水平来比较两个或更多个测试样品之间的靶核酸负荷。技术研发人员：S·L·孔,S·M·刘,A·英,M·R·富尔塔多,G·Y·H·王,D·肯尼,J·H·Y·潘,X·徐受保护的技术使用者：生命科技公司技术研发日：技术公布日：2024/8/1