RNA构建体及其用途的制作方法

背景技术：

1、使用rna多核苷酸作为治疗剂是一个新兴领域。

技术实现思路

1、本公开确定了与rna体外生产(例如rna治疗剂)相关的某些挑战。

2、例如，在一些实施方案中，本公开确定了在表达由rna治疗剂编码的多肽时可能遇到的某些问题的来源。除其他事项外，本公开提供了用于改善加帽效率(例如，体外转录反应中加帽转录物的百分比)、rna制剂的质量(例如，体外转录的rna的质量，例如，产生的短多核苷酸副产物的量)、编码有效负载的rna的翻译效率和/或由rna编码的多肽有效负载的表达的技术。在一些实施方案中，可以利用包含以下的rna多核苷酸来改善rna编码的有效负载的翻译效率和/或表达：如本文所定义和描述的5'帽；包含如本文所定义和描述的帽近端序列的5'utr，和编码有效负载的序列。不希望受特定理论的束缚，本公开提出，可以通过使用如本文所述的5'帽结构与模板dna的某些转录起始位点序列的组合来实现改善的rna转录、加帽效率、翻译效率和/或多肽有效负载表达和/或减少的转录副产物形成。

3、在一些实施方案中，本公开认识到某些转录起始位点，例如当与特定帽一起使用时，提供改善的rna转录、加帽效率、翻译效率和/或多肽有效负载表达和/或减少的副产物形成。

4、t7 rna聚合酶最常利用ggg转录起始位点(例如，生成前三个残基n1、n2和n3均为“g”的rna)，此外，据报告，其更倾向于以“g”作为起始残基(例如，生成第一个残基n1为“g”的rna)。conrad等人(2020)communications biology 3:439。比较具有不同起始残基的模板的t7转录的研究报告显示，以“a”开始的转录物的水平仅为以“g”开始的转录物所观察到的水平的25％。milligan等人(1987)nucleic acids research 15:8783-8798。

5、常用的二核苷酸帽的3'末端也采用“g”(例如，m27,2’-ogppspg“β-s-arca”或“d1”)。grudzien-nogalska等人rna 13:1745-1755。事实上，某些此类帽，例如β-s-arca，具有诸多优势，包括对人脱帽酶(kowalska等人(2008)rna 14:1119-1131)和具有四三肽重复序列的干扰素诱导蛋白(interferon-induced proteins with tetratricopeptide r epeats，ifit)更具抗性，从而抑制cap0依赖性翻译(diamond等人(2014)cytokine&growth factorreviews 25:543-550；以及miedziak等人(2019)rna 25:58-68)。然而，有时会观察到较差的加盖效率。不受任何特定理论的束缚，本公开提出，转录反应中与gtp的竞争可能导致这种较差的加盖效率。

6、此外，本公开提供了一个令人惊讶的发现，即dna模板序列，特别是dna模板中的转录起始位点的序列，可能会影响某些帽(例如，3端g帽)在如本文所述的体外转录反应中的有用性。除其他事项外，例如，本公开表明，包括ggg转录起始序列的dna模板，例如当利用3'端帽时，可以促进不需要的短poly(g)副产物的产生。因此，本公开确定了某些体外转录策略的问题的来源，并且进一步提供了关于体外转录的令人惊讶的见解，包括对此类问题的解决方案。

7、例如，本公开提供了这样一种见解，即包含某些起始序列的rna转录物(例如，在+2位置处包含嘧啶碱基(c或u)的rna转录物，诸如gcg、gug或gca)与相同位置的嘌呤碱基(a或g)相比表现出某些益处。例如，在一些实施方案中，本公开提供了这样一种见解，即与在相同位置具有嘌呤碱基(a或g)(诸如ggg作为初始序列)相比，在+2位置具有嘧啶碱基(c或u)的rna转录物可提高转录效率和/或翻译，提高加盖效率，降低免疫原性和/或改善和/或延长表达。

8、另外地或另选地，在一些实施方案中，本公开认识到某些5'帽结构当与某些转录起始位点配对时，提供改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。在一些实施方案中，本公开提供到，某些5'帽结构(例如，m2(7,3′o)gppp(m2′o)apg)当与某些转录起始位点(例如，agn，诸如aga)配对时，与包含与其他转录起始序列组合的其他5'帽结构(诸如，例如，与ggg转录起始序列组合使用的β-s-arca帽)的转录物相比，导致更高的加帽效率、更低的免疫原性以及大大改善和延长的表达。在一些实施方案中，本公开还提供到，某些三核苷酸5'帽结构(例如，m2(7,3′o)gppp(m2′o)apg)可与不完全互补于5'帽的转录起始位点组合使用(例如，在一些实施方案中，本公开提供到，m2(7,3′o)gppp(m2′o)apg可与ggg或gcg转录起始位点组合使用)。这可能是有利的，因为它允许并入具有某些期望特性(诸如，例如，降低的免疫原性)的5'帽，而不必产生与所选5'帽互补的新dna模板。

9、在一些实施方案中，本公开提供了这样一种见解，即用某些arca帽结构产生的rna当与除ggg起始序列(其一直被认为是arca帽的优选起始位点)之外的某些转录起始位点配对时，可以令人惊讶地产生比用相同帽和ggg起始序列产生的rna更高的蛋白质表达。例如，在一些实施方案中，本公开已证明，与d1帽和ggg起始序列相比，用β-s-arca d1帽(“d1帽”)和gcg起始序列产生的rna令人惊讶地产生了更高的蛋白质表达。

10、更进一步地，另外地或另选地，在一些实施方案中，本公开认识到靠近5'帽的特定序列的标识可以影响相关有效负载的rna转录和/或翻译效率。不希望受任何特定理论的束缚，本公开提出，基于5'帽下游一个或多个核苷酸(例如，如本文所公开的帽近端序列)的标识，eif4e与ifit1竞争结合rna多核苷酸。

11、因此，在一些实施方案中，本公开尤其提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：(i)5'帽；(ii)帽近端序列，例如，如本文所公开的；和(iii)编码有效负载的序列。本文还公开了制备和使用所述组合物或医药制剂来例如诱导受试者的免疫应答的方法。

12、在一些实施方案中，本公开认识到ggg转录起始位点当与如本文所定义和描述的某些5'帽配对时，提供改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

13、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

14、(i)所述5'帽是包含n1pn2的三核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且n2是rna多核苷酸的位置+2，并且其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是c并且n2是g；(b)n1是u并且n2是g；或(c)n1是a并且n2是g；并且

15、(ii)所述帽近端序列包含：

16、三核苷酸帽结构的n1和n2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3和n4是g，并且n5选自：a、c、g和u。

17、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

18、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

19、(i)所述5'帽是包含n1pn2的三核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且n2是rna多核苷酸的位置+2，并且其中n1和n2各自是g；并且

20、(ii)所述帽近端序列包含：

21、三核苷酸帽结构的n1和n2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是g，并且n4和n5各自选自：a、c、g和u。

22、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

23、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

24、(i)所述5'帽是包含n1的二核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且其中n1是g；并且

25、(ii)所述帽近端序列包含：

26、二核苷酸帽结构的n1以及包含分别在rna多核苷酸的位置+2、+3、+4和+5处的n2n3n4n5的序列，其中n2和n3各自是g，并且n4和n5各自选自：a、c、g和u。

27、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

28、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

29、(i)所述5'帽是包含n1pn2pn3的四核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，n2是rna多核苷酸的位置+2并且n3是多核苷酸的位置+3，并且其中n1、n2和n3选自以下组合之一：(a)n1是c，n2是g并且n3是g；(b)n1是u，n2是g并且n3是g；或(c)n1是a，n2是g并且n3是g；并且

30、(ii)所述帽近端序列包含：

31、四核苷酸帽结构的n1、n2和n3以及包含分别在rna多核苷酸的位置+4和+5处的n4n5的序列，其中n4是g并且n5选自：a、c、g和u。

32、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

33、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

34、(i)所述5'帽是包含n1pn2pn3的四核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，n2是rna多核苷酸的位置+2并且n3是多核苷酸的位置+3，并且其中n1是g，n2是g并且n3是g；并且

35、(ii)所述帽近端序列包含：

36、四核苷酸帽结构的n1、n2和n3以及包含分别在rna多核苷酸的位置+4和+5处的n4n5的序列，其中n4和n5各自选自：a、c、g和u。

37、在一些实施方案中，本公开认识到转录起始位点+2位置处的嘧啶可以改善加帽效率(例如，体外转录反应中加帽转录物的百分比)、rna制剂的质量(例如，体外转录的rna的质量，例如，产生的短多核苷酸副产物的量)、编码有效负载的rna的翻译效率和/或由rna编码的多肽有效负载的表达。在一些实施方案中，可以独立于5'utr的标识、加帽方法(例如，酶加帽与共转录加帽)、帽结构(例如，cap0、cap1或cap2)、编码序列、核糖核苷酸的类型(例如，修饰的核苷酸与非修饰的核苷酸)或它们的组合观察到此类技术效果。

38、例如，在一些实施方案中，本公开认识到gcg转录起始位点当与如本文所定义和描述的某些5'帽配对时，提供改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

39、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

40、(i)所述5'帽是包含n1pn2的三核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1并且n2是rna多核苷酸的位置+2，并且其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是g并且n2是g；(b)n1是u并且n2是g；(c)n1是a并且n2是g；或(d)n1是c并且n2是g；并且

41、(ii)所述帽近端序列包含：

42、三核苷酸帽结构的n1和n2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是c，n4是g并且n5选自：a、c、g和u。

43、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

44、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

45、(i)所述5'帽是包含n1pn2的三核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且n2是rna多核苷酸的位置+2，并且其中n1是g并且n2是c；并且

46、(ii)所述帽近端序列包含：

47、三核苷酸帽结构的n1和n2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是g，并且n4和n5各自选自：a、c、g和u。

48、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

49、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

50、(i)所述5'帽是包含n1的二核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且其中n1是g；并且

51、(ii)所述帽近端序列包含：二核苷酸帽结构的n1以及包含分别在rna多核苷酸的位置+2、+3、+4和+5处的n2n3n4n5的序列，其中n2是嘧啶(例如，c或u)，并且n3、n4和n5各自选自：a、c、g和u。在一些实施方案中，n3是g或a，并且n4和n5单独且独立地选自：a、c、g和u。

52、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

53、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

54、(i)所述5'帽是包含n1的二核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且其中n1是g；并且

55、(ii)所述帽近端序列包含：

56、二核苷酸帽结构的n1以及包含分别在rna多核苷酸的位置+2、+3、+4和+5处的n2n3n4n5的序列，其中n2是c，n3是g，并且n4和n5各自选自：a、c、g和u。

57、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

58、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

59、(i)所述5'帽是包含n1pn2pn3的四核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，n2是rna多核苷酸的位置+2并且n3是多核苷酸的位置+3，并且其中n1、n2和n3选自以下组合之一：(a)n1是c，n2是g并且n3是c；(b)n1是u，n2是g并且n3是c；或(c)n1是a，n2是g并且n3是c；并且

60、(ii)所述帽近端序列包含：

61、四核苷酸帽结构的n1、n2和n3以及包含分别在rna多核苷酸的位置+4和+5处的n4n5的序列，其中n4是g并且n5选自：a、c、g和u。

62、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

63、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

64、(i)所述5'帽是包含n1pn2pn3的四核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，n2是rna多核苷酸的位置+2并且n3是多核苷酸的位置+3，并且其中n1是g，n2是c并且n3是g；并且

65、(ii)所述帽近端序列包含：

66、四核苷酸帽结构的n1、n2和n3以及包含分别在rna多核苷酸的位置+4和+5处的n4n5的序列，其中n4和n5各自选自：a、c、g和u。

67、在一些实施方案中，本公开认识到cgc转录起始位点当与如本文所定义和描述的某些5'帽配对时，提供改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

68、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

69、(i)所述5'帽是包含n1pn2的三核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1并且n2是rna多核苷酸的位置+2，并且其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是g并且n2是c；(b)n1是u并且n2是c；(c)n1是a并且n2是c；或(d)n1是c并且n2是c；并且

70、(ii)所述帽近端序列包含：

71、三核苷酸帽结构的n1和n2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是g，n4是c并且n5选自：a、c、g和u。

72、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

73、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

74、(i)所述5'帽是包含n1pn2的三核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且n2是rna多核苷酸的位置+2，并且其中n1是c并且n2是g；并且

75、(ii)所述帽近端序列包含：

76、三核苷酸帽结构的n1和n2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是c，并且n4和n5各自选自：a、c、g和u。

77、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

78、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

79、(i)所述5'帽是包含n1pn2pn3的四核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，n2是rna多核苷酸的位置+2并且n3是多核苷酸的位置+3，并且其中n1、n2和n3选自以下组合之一：(a)n1是g，n2是c并且n3是g；(b)n1是u，n2是c并且n3是g；或(c)n1是a，n2是c并且n3是g；并且

80、(ii)所述帽近端序列包含：

81、四核苷酸帽结构的n1、n2和n3以及包含分别在rna多核苷酸的位置+4和+5处的n4n5的序列，其中n4是c并且n5选自：a、c、g和u。

82、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

83、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

84、(i)所述5'帽是包含n1pn2pn3的四核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，n2是rna多核苷酸的位置+2并且n3是多核苷酸的位置+3，并且其中n1是c，n2是g并且n3是c；并且

85、(ii)所述帽近端序列包含：

86、四核苷酸帽结构的n1、n2和n3以及包含分别在rna多核苷酸的位置+4和+5处的n4n5的序列，其中n4和n5各自选自：a、c、g和u。

87、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

88、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

89、(i)所述5'帽是包含n1pn2的三核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，并且n2是rna多核苷酸的位置+2，并且其中n1是a并且n2是u；并且

90、(ii)所述帽近端序列包含：

91、三核苷酸帽结构的n1和n2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是a，并且n4和n5各自选自：a、c、g和u。

92、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

93、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

94、(i)所述5'帽是包含n1pn2pn3的四核苷酸帽结构，其中n1是rna多核苷酸的位置+1，n2是rna多核苷酸的位置+2并且n3是多核苷酸的位置+3，并且其中n1是a，n2是u并且n3是a；并且

95、(ii)所述帽近端序列包含：

96、四核苷酸帽结构的n1、n2和n3以及包含分别在rna多核苷酸的位置+4和+5处的n4n5的序列，其中n4和n5各自选自：a、c、g和u。

97、另外地或另选地，在一些实施方案中，本公开认识到某些5'帽结构(例如，如本文所定义和描述)当与某些转录起始位点配对时，提供改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。在一些实施方案中，5'帽是二核苷酸帽结构(例如，包含n1，其中n1是本文所定义和描述的)、三核苷酸帽结构(例如，包含n1pn2，其中n1和n2如本文所定义和描述)，或四核苷酸帽结构(例如，包含n1pn2pn3，其中n1、n2和n3如本文所定义和描述)。在一些实施方案中，5'帽包含g*，其中：

98、g*包含式(i)的结构：

99、

100、或其盐，其中r2、r3和x如本文所定义和描述。

101、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1的二核苷酸帽结构的5'帽，其中n1是c，当与gcg转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1的二核苷酸帽结构的5'帽，其中n1是g，当与cgc转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。

102、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1pn2的三核苷酸帽结构的5'帽，其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是c并且n2是g；(b)n1是u并且n2是g；(c)n1是a并且n2是g；或(d)n1和n2各自为g，当与ggg转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。

103、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1pn2的三核苷酸帽结构的5'帽，其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是g并且n2是g；(b)n1是u并且n2是g；(c)n1是a并且n2是g；(d)n1是c并且n2是g；或(e)n1是g并且n2是c；当与gcg转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。

104、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1pn2的三核苷酸帽结构的5'帽，其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是g并且n2是c；(b)n1是u并且n2是c；(c)n1是a并且n2是c；(d)n1是c并且n2是c；或(e)n1是c并且n2是g；当与cgc转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。

105、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1pn2pn3的四核苷酸帽结构的5'帽，其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是c，n2是g并且n3是g；(b)n1是u，n2是g并且n3是g；(c)n1是a，n2是g并且n3是g；或(d)n1是g，n2是g并且n3是g，当与ggg转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。

106、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1pn2pn3的四核苷酸帽结构的5'帽，其中n1和n2选自以下组合之一：(a)n1是c，n2是g并且n3是c；(b)n1是u，n2是g并且n3是c；(c)n1是a，n2是g并且n3是c；或(d)n1是g，n2是c并且n3是g；当与gcg转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。

107、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*n1pn2pn3的四核苷酸帽结构的5'帽，其中n1和n2选自以下之一：(a)n1是g，n2是c并且n3是g；(b)n1是u，n2是c并且n3是g；(c)n1是a，n2是c并且n3是g；(d)n1是c，n2是g并且n3是c；当与cgc转录起始位点组合时，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。

108、在一些实施方案中，本公开认识到具有包含g*apg(例如，m2(7,3′o)gppp(m2′o)apg)的三核苷酸帽结构的5'帽，当与agn(例如，aga或agc)转录起始位点组合时，例如，如与ggg转录起始位点相比，表现出改善的rna转录、翻译效率和/或多肽有效负载表达。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

109、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

110、(i)所述5'帽是m2(7,3′o)gppp(m2′o)a1pg2，其中a1是rna多核苷酸的位置+1，并且g2是rna多核苷酸的位置+2；并且

111、(ii)所述帽近端序列包含：

112、5'帽的a1和g2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3-n5选自：a、c、g和u。

113、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

114、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

115、(i)所述5'帽是m2(7,3′o)gppp(m2′o)a1pg2，其中a1是rna多核苷酸的位置+1，并且g2是rna多核苷酸的位置+2；并且

116、(ii)所述帽近端序列包含：

117、5'帽的a1和g2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是a，并且n4和n5选自：a、c、g和u。

118、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

119、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

120、(i)所述5'帽是m2(7,3′o)gppp(m2′o)a1pg2，其中a1是rna多核苷酸的位置+1，并且g2是rna多核苷酸的位置+2；并且

121、(ii)所述帽近端序列包含：

122、5'帽的a1和g2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3和n4是g，并且n5选自：a、c、g和u。

123、在一些实施方案中，本公开提供了包含rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含：

124、5'帽；包含所述rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列；以及编码有效负载的序列，其中：

125、(i)所述5'帽是m2(7,3′o)gppp(m2′o)a1pg2，其中a1是rna多核苷酸的位置+1，并且g2是rna多核苷酸的位置+2；并且

126、(ii)所述帽近端序列包含：

127、5'帽的a1和g2以及包含分别在rna多核苷酸的位置+3、+4和+5处的n3n4n5的序列，其中n3是c，n4是g，并且n5选自：a、c、g和u。

128、本公开提供了包含编码基因产物的加帽rna多核苷酸的组合物或医药制剂，所述rna多核苷酸包含下式：

129、

130、其中r1是ch3，r2和r3如上文和本文所定义，

131、其中b1是任何核碱基，优选地是a；b2是任何核碱基，优选地是g；b3是任何核碱基，优选地是a或c；b4是任何核碱基；并且b5是任何核碱基，并且

132、其中，当将rna多核苷酸施用于受试者时，在施用后约6小时和施用后约48小时所编码的基因产物的表达水平相差不超过5倍。

133、本文提供了一种包含本文公开的rna多核苷酸的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本文公开的组合物或医药制剂。

134、本文还提供了一种通过将rna多核苷酸与脂质合并以形成包封所述rna的脂质纳米颗粒来制造例如包含本文公开的rna多核苷酸的药物组合物的方法。

135、本公开提供了一种适合于产生加帽rna的核酸模板，其中从核酸模板的模板链转录的前五个核苷酸包括序列序列n1pn2pn3pn4pn5，其中n1是任何核苷酸，优选地是t；n2是任何核苷酸，优选地是c；n3是任何核苷酸，优选地是t或g；n4是任何核苷酸；并且n5是任何核苷酸。在一些实施方案中，dna模板包含：编码5'utr的序列、编码有效负载的序列、编码3'utr的序列和编码polya序列的序列。

136、本文提供了一种体外转录反应，所述体外转录反应包含：

137、(i)模板dna，所述模板dna包含与本文公开的rna多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；

138、(ii)聚合酶；和

139、(iii)rna多核苷酸。

140、本文还提供了一种从所提供的体外转录反应分离的rna多核苷酸。

141、本文还提供了一种组合物，所述组合物包含含有与所提供的rna多核苷酸序列互补的序列的dna多核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的dna多核苷酸可用于转录本文公开的rna多核苷酸。

142、本公开提供了一种方法，所述方法包括：向受试者施用包含本文公开的rna多核苷酸的药物组合物，所述rna多核苷酸配制在脂质纳米颗粒(lnp)或脂质复合物(lipoplex，lpx)颗粒中，例如，如本文所公开的。在一些实施方案中，本文所述的所提供的组合物、医药制剂和治疗剂在以lnp制剂形式施用时增加rna的表达。

143、本文还提供了一种诱导受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用包含本文公开的rna多核苷酸的药物组合物，所述rna多核苷酸配制在脂质纳米颗粒(lnp)或脂质复合物(lpx)颗粒中，例如，如本文所公开的。

144、本文提供了一种通过施用包含本文公开的rna多核苷酸的药物组合物对受试者进行疫苗接种的方法，所述rna多核苷酸配制在脂质纳米颗粒(lnp)或脂质复合物(lpx)颗粒中，例如，如本文所公开的。

145、本公开提供了一种减少rna多核苷酸与ifit1相互作用的方法，所述rna多核苷酸包含5'帽和包含rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列，所述方法包括以下步骤：提供rna多核苷酸的变体，所述变体与亲本rna多核苷酸的区别在于帽近端序列内的一个或多个残基的取代；以及确定变体与ifit1的相互作用相对于亲本rna多核苷酸的相互作用减少。

146、本文还提供了一种产生多肽的方法，所述方法包括以下步骤：提供rna多核苷酸，所述rna多核苷酸包含5'帽，包含rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列，以及编码有效负载的序列；其中rna多核苷酸的特征在于，当在施用rna多核苷酸或包含所述rna多核苷酸的组合物的生物体中评估时，相对于适当的参考比较物，观察到有效负载的表达升高和/或表达持续时间增加。

147、本文提供了一种增加rna多核苷酸的可翻译性的方法，所述rna多核苷酸包含5'帽，包含rna多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和+5的帽近端序列，以及编码有效负载的序列，所述方法包括以下步骤：提供rna多核苷酸的变体，所述变体与亲本rna多核苷酸的区别在于帽近端序列内的一个或多个残基的取代；以及确定变体的表达相对于亲本rna多核苷酸的表达增加。

148、本文还提供了一种改善rna转录物的加帽效率(例如，体外转录反应中加帽转录物的百分比)的方法，所述改进包括在用于体外转录的dna模板中的转录起始位点的+2位置处包含嘧啶。示例性嘧啶包括例如c或u。在一些实施方案中，转录起始位点的+1位置是g。在一些实施方案中，转录起始位点的+3位置是嘧啶或嘌呤。在一些实施方案中，转录起始位点可以是gcg、gug或gca。在一些实施方案中，可以独立于5'utr的标识、加帽方法(例如，酶加帽与共转录加帽)、帽结构(例如，cap0、cap1或cap2)、编码序列、核糖核苷酸的类型(例如，修饰的核苷酸与非修饰的核苷酸)、配制物(例如，脂质复合物与脂质纳米颗粒)或它们的组合观察到此类改善。

149、本文还提供了一种改善rna制剂质量(例如，体外转录的rna的质量，例如，产生的短多核苷酸副产物的量)的方法，所述改善包括在用于体外转录的dna模板中的转录起始位点的+2位置处包含嘧啶。示例性嘧啶包括例如c或u。在一些实施方案中，转录起始位点的+1位置是g。在一些实施方案中，转录起始位点的+3位置是嘧啶或嘌呤。在一些实施方案中，转录起始位点可以是gcg、gug或gca。在一些实施方案中，可以独立于5'utr的标识、加帽方法(例如，酶加帽与共转录加帽)、帽结构(例如，cap0、cap1或cap2)、编码序列、核糖核苷酸的类型(例如，修饰的核苷酸与非修饰的核苷酸)、配制物(例如，脂质复合物与脂质纳米颗粒)或它们的组合观察到此类改善。

150、本文还提供了一种改善编码有效负载的rna的翻译效率和/或由rna编码的多肽有效负载的表达的方法，所述改善包括在用于体外转录的dna模板中的转录起始位点的+2位置处包含嘧啶。示例性嘧啶包括例如c或u。在一些实施方案中，转录起始位点的+1位置是g。在一些实施方案中，转录起始位点的+3位置是嘧啶或嘌呤。在一些实施方案中，转录起始位点可以是gcg、gug或gca。在一些实施方案中，可以独立于5'utr的标识、加帽方法(例如，酶加帽与共转录加帽)、帽结构(例如，cap0、cap1或cap2)、编码序列、核糖核苷酸的类型(例如，修饰的核苷酸与非修饰的核苷酸)、配制物(例如，脂质复合物与脂质纳米颗粒)或它们的组合观察到此类改善。

151、本文还提供了一种提供包含5'帽、帽近端序列和有效负载序列的rna多核苷酸的框架的方法，所述方法包括以下步骤：

152、评估rna多核苷酸的至少两种变体，其中：

153、每种变体包括相同的5'帽和有效负载序列；并且

154、所述变体在帽近端序列的一个或多个特定残基处彼此不同；

155、其中所述评估包括确定有效负载序列的表达水平和/或表达持续时间；以及

156、选择5'帽和帽近端序列的至少一种组合，所述组合相对于至少一种其他组合展示出升高的表达。