用于在细胞膜上表达抗原的组合物和方法与流程

本发明总体上属于疫苗领域。

背景技术：

1、水产养殖在生产方面已经经历巨大的增长，在1990-2018年期间增长>527％。2018年，水产养殖贡献了全球水生生物总产量的大约46％(1.79亿吨)和人类消费的海产品(鱼类、甲壳类动物、软体动物和其它水生动物，不包含水生哺乳动物、爬行动物、海藻和其它水生植物)的52％。

2、商业水产养殖受到主要由细菌、病毒、寄生虫以及在较小程度上由真菌引起的传染性疾病的影响。细菌性疾病会造成重大的生物损失，从而造成经济损失。虽然这些通常可以用抗生素来控制，但由于细菌物种(其中一些也是人类病原体)之间耐药性机制的发展和转移，滥用这些药物最终会对人类健康构成威胁。另外，这些病原体中的一些病原体很难在培养物中生长。因此，保护免受这些病原体影响的经修饰的活疫苗或灭活疫苗在商业上不可行。

3、dna疫苗由于其稳定性和递送的简便性，已经成为用于产生抗原特异性免疫应答的有吸引力的方法。dna疫苗可以容易地以高纯度大规模制备，重复地施用，并且相对于蛋白质和其它生物聚合物高度稳定。

4、在可以构建的多种形式的核酸疫苗中，环状dna质粒是最简单的。dna疫苗接种涉及用含有编码抗原的基因(多个基因)的环状dna质粒进行免疫。事实上，注射游离dna(裸dna)刺激对基因疫苗编码的蛋白质(抗原)的有效且长期免疫应答。当将质粒dna注射到个体体内时，质粒被细胞吸收并且其遗传信息被翻译成对蛋白进行免疫。这使得宿主免疫系统能够对抗原做出应答。

5、然而，dna疫苗相对新并且需要提高这些疫苗的效率。

技术实现思路

1、在第一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从n末端至c末端包括：

2、a)分泌蛋白或第一膜结合蛋白的n末端分泌信号序列；

3、b)来自无包膜病毒的抗原；

4、c)第二膜结合蛋白的跨膜结构域。

5、在某些实施例中，所述第一膜结合蛋白与所述第二膜结合蛋白相同。在某些实施例中，所述膜结合蛋白是病毒性出血性败血症病毒g蛋白(vhsv-g)。优选地，所述n末端分泌信号序列与seq id no:7或seq id no:48至少90％相同，或者其中所述分泌信号序列包括seq id no:48或与seq id no:48至少90％相同的序列的一部分，其中所述部分包括seq idno:7或与seq id no:7至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述n末端分泌信号序列与seq id no:7至少90％相同，并且所述n末端分泌信号中的至少一半不同氨基酸是保守取代。

6、在某些实施例中，所述跨膜结构域与seq id no:8或seq id no:49至少90％相同，或者其中所述跨膜片段包括seq id no:49或与seq id no:49至少90％相同的序列的一部分，其中所述部分包括seq id no:8或与seq id no:8至少90％相同的序列。优选地，所述跨膜结构域与seq id no:8至少90％相同，并且所述n末端分泌信号中的至少一半不同氨基酸是保守取代。

7、在某些实施例中，所述无包膜病毒是影响鱼类的无包膜病毒，所述无包膜病毒可以选自由以下组成的组：鱼类心肌炎病毒(pmcv)、鱼类正呼肠孤病毒(prv)、传染性胰腺坏死病毒(ipnv)和β野田村病毒(betanodavirus)。

8、在某些实施例中，所述抗原由鱼类心肌炎病毒(pmcv)的orf-1编码。在一些实施例中，所述抗原是蛋白质，所述蛋白质从n末端至c末端包括：

9、a.与seq id no:34或seq id no:35至少90％相同、或至少91％相同、或至少92％相同、或至少93％相同、或至少94％相同、或至少95％相同、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同、或至少99％相同或100％相同的序列，以及

10、b.与seq id no:25-33中的任一者至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，

11、其中，

12、i)所述蛋白质缺乏seq id no:15或与seq id no:15至少90％相同的序列；和/或

13、ii)与seq id no:1相比，所述蛋白质包括内部缺失，所述内部缺失的长度为至少四个连续氨基酸。

14、在某些实施例中，所述蛋白质与seq id no:11或seq id no:12至少90％相同。

15、在某些实施例中，所述蛋白质与seq id no:25至少95％相同，并且缺乏seq idno:14或与seq id no:14至少90％相同的序列。优选地，所述蛋白质缺乏seq id no:4、seqid no:5、seq id no:15中的一者或多者或与其至少90％相同的序列。

16、在某些其它实施例中，本发明的蛋白质包含与seq id no:26至少95％相同的序列，并且缺乏seq id no:14或与seq id no:14至少90％相同的序列。所述蛋白质可以包含与seq id no:26至少95％相同的序列，并且缺乏seq id no:14或与seq id no:14至少90％相同的序列，并且进一步缺乏seq id no:5、15或24中的一者或多者或与其至少90％相同的序列。

17、在其它实施例中，所述蛋白质包含与seq id no:27至少95％相同的序列，并且缺乏seq id no:14或与seq id no:14至少90％相同的序列。所述蛋白质可以包含与seq idno:27至少95％相同的序列，并且缺乏seq id no:14或与seq id no:14至少90％相同的序列，并且进一步缺乏seq id no:3、15或24中的一者或多者或与其至少90％相同的序列。

18、在其它实施例中，所述蛋白质包含与seq id no:28至少90％相同的序列。任选地，所述蛋白质缺乏seq id no:3、4或24中的一者或多者或与其至少90％相同的序列。

19、在其它实施例中，所述蛋白质包括seq id no:29或seq id no:30或与这些序列中的任一者至少95％、或96％、或97％、或98％或99％相同的序列。优选地，所述蛋白质缺乏seq id no:3或seq id no:24或与seq id no:3或seq id no:24至少90％相同的氨基酸序列中的至少一者。

20、在其它实施例中，所述蛋白质包括seq id no:32或与其至少95％、或96％、或97％、或98％或99％相同的序列，并且任选地缺乏seq id no:14或seq id no:15或与seqid no:14或seq id no:15至少90％相同的氨基酸序列中的至少一者。

21、在其它实施例中，所述蛋白质包括seq id no:33或与其至少95％、或96％、或97％、或98％或99％相同的序列，并且任选地缺乏seq id no:24，与seq id no:24至少90％相同的氨基酸序列。

22、在上文所描述的实施例中的任何实施例中，所述蛋白质可以进一步任选地缺乏seq id no:2和13或与seq id no:2或13至少90％相同的氨基酸序列中的至少一者。

23、在某些实施例中，所述蛋白质包括seq id no:11或12或与seq id no:11或seq idno:12至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％相同的序列。

24、在某些实施例中，所述蛋白质包含seq id no:15或与其至少90％相同的序列，以及seq id no:4、5、25、26 27、29、30、32(或与seq id no:4、5、25、26 27、29、30或32至少90％相同的氨基酸序列)中的任一者，其中与seq id no:1相比，所述蛋白质包括内部缺失，所述内部缺失的长度为至少四个连续氨基酸，并且任选地，其中所述蛋白质包括替代所述内部缺失的接头。

25、在又其它实施例中，所述蛋白质缺乏seq id no:13或与seq id no:13至少90％相同的序列，并且含有seq id no:25或与seq id no:25至少95％、或96％、或97％、或98％或99％相同的序列。

26、在第二方面，本发明提供了一种核酸序列，所述核酸序列编码根据本发明的第一方面的实施例中的任何实施例的融合蛋白。

27、在第三方面，本发明提供了一种盒，所述盒包括根据第二方面的任何实施例的核酸序列。

28、在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体包括根据本发明的第三方面的任何实施例的盒。

29、在某些实施例中，所述载体还编码核酸序列，所述核酸序列编码免疫调节剂。在某些实施例中，所述免疫调节剂是如包括seq id no:6的ifnb型干扰素等干扰素，其中编码干扰素的所述核酸序列与seq id no:18 65-90％相同，或与seq id no:19 65-90％相同，并且其中密码子频率保留在所述核酸序列中。在某些实施例中，编码干扰素的核酸序列包括seq id no:17或seq id no:20或与seq id no:17或seq id no:20至少90％相同的核酸序列，其中编码干扰素的所述核酸序列编码seq id no:6或与或seq id no:6 95％相同的氨基酸序列。

30、在某些实施例中，所述载体可以是质粒载体或病毒载体。

31、在第八方面，本公开提供了一种疫苗，所述疫苗包括根据本发明的第一方面的任何实施例的融合蛋白或根据本发明的第四方面的载体。在某些实施例中，所述疫苗进一步包括佐剂。在某些实施例中，所述疫苗还提供了载剂。在一个实施例中，所述载剂是脂质或脂质体载剂。

32、在某些实施例中，所述疫苗是多价疫苗，并且包括一种或多种另外的抗原，优选地选自由以下组成的组：sav(鲑科鱼甲病毒，包含sav-1、sav-2、sav-3、sav-4、sav-5和sav-6)、isav(传染性鲑鱼贫血病毒)、ipnv(传染性胰腺坏死病毒)、aspv(大西洋鲑鱼痘病毒)、ihnv(传染性造血坏死病毒)、vhsv(病毒性出血性败血症病毒)、prv(鱼类正呼肠孤病毒)、杀鲑气单胞菌亚种(aeromonas salmonicida subs.salmonicida)、o1血清型鳗(利斯顿氏)弧菌(vibrio(listonella)anguillarum serotype o1)、o2a血清型鳗(利斯顿氏)弧菌(vibrio(listonella)anguillarum serotype o2a)、杀鲑弧菌(vibrio salmonicida)、粘莫里特拉氏菌(moritella viscosa)和海虱蛋白。

33、在第六方面，本发明提供了一种保护鲑科鱼免受pmcv感染的方法，所述方法包括向有需要的鲑科鱼施用根据本发明的第六方面的任何实施例的疫苗。在某些实施例中，所述鲑科鱼的重量介于15与200克之间。在某些实施例中，所述鲑科鱼是大西洋鲑鱼(大西洋鲑)、虹鳟鱼(rainbow trout)(麦奇钩吻鲑(oncorhynchus mykiss))、银鲑鱼(cohosalmon)(银大麻哈鱼(oncorhynchus kisutch))或大鳞大麻哈鱼(chinook salmon)(大鳞钩吻鲑(oncorhynchus tshawytscha))。