靶向ACTL6B的反义寡核苷酸的制作方法

背景技术：

1、tar dna结合蛋白43(tdp-43、)是一种多功能的rna/dna结合蛋白，参与rna相关代谢。tdp-43沉积物的失调在患有运动神经元疾病：肌萎缩侧索硬化(als)和额颞叶变性(ftld)患者的大脑和脊髓中充当包涵体(prasad等人，front.mol.neurosci.，2019)。

2、tdp-43耗竭在一系列疾病中表现出来，称为tdp-43病理，并包括诸如以下的疾病：肌萎缩侧索硬化症(als)、额颞叶变性(ftld)、进行性核上麻痹(psp)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

3、actl6b参与神经元分化过程中的染色质重塑。它是actl6a的一种剪接变体，并且在干细胞完成分化为成熟神经元后取代actl6a。

4、我们发现，actl6b的剪接至少部分受tdp-43控制，这是由于actl6b前mrna序列中存在tdp-43结合位点。

技术实现思路

1、本发明人令人惊讶地确定，如果细胞中的tdp-43被耗竭，actl6bmrna剪接会发生变化。

2、因此，本发明人假设，修改actl6b剪接模式可能能够改善tdp-43耗竭对神经元细胞的不利影响。

3、这里，本发明人已经使用反义寡核苷酸actl6b剪接调节剂来增加actl6b的表达。

4、在一个方面，本发明提供了一种反义寡核苷酸肌动蛋白样6b(actl6b)剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为8个至40个核苷酸，并包含长度为至少8个核苷酸的与actl6b前体mrna互补的连续核苷酸序列。

5、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可能能够增加tdp-43耗竭的细胞中肌动蛋白样6b(actl6b)的表达。

6、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可能能够降低tdp-43耗竭的细胞中actl6b突变体多肽(诸如actl6b的剪接变体)的表达。

7、本发明人令人惊讶地确定，在tdp-43耗竭的细胞中，观察到包括另外的外显子的actl6b剪接变体的表达增加。这导致功能活性野生型(wt)actl6b多肽的产生减少。在一些实施例中，与野生型actl6b多肽序列相比时，剪接变体可以因此包含由另外的外显子编码的多肽序列。

8、在一些实施例中，与野生型actl6b多肽序列相比时，突变体actl6b剪接变体可以包含插入，诸如约23个氨基酸的插入。

9、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与actl6b前体mrna中的剪接增强子位点互补。

10、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自seq idno：199至205的序列互补。

11、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自seq idno：6至97和190至193的序列互补。

12、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自seq idno：26、28、29、30、31、32、33、38、39、46、47、48、52、53、55和72的序列互补。

13、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自seq idno：28、29、30、31、32、33和47的序列互补。

14、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以是选自seq idno 98至189和194至197的序列，或其至少10个连续核苷酸。

15、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以为选自由seqid no：118、120、121、122、123、124、125、130、131、138、139、140、144、145、147和164组成的组的序列或其至少10个连续核苷酸。

16、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以是选自由seqid no：120、121、122、123、124、125和139组成的组的序列或其至少10个连续核苷酸。

17、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的长度可以为至少12个核苷酸，诸如长度为至少13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个核苷酸。

18、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与反义寡核苷酸剪接调节剂是长度相同的。

19、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以包含一个或多个经修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷，其可以独立地选自由以下项组成的组：2′-o-烷基-rna；2′-o-甲基rna(2′-ome)；2′-烷氧基-rna；2′-o-甲氧基乙基-rna(2′-moe)；2′-氨基-dna；2′-氟-rna；2′-氟-dna；阿糖核酸(ana)；2′-氟-ana；锁核酸(lna)或它们的任何组合。

20、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以包含2'-o-甲氧基乙基-rna(2′-moe)核苷，其任选地通过硫代磷酸酯核苷间键连接。

21、在一些实施例中，经修饰的核苷中的一者或多者可以是锁核酸核苷(lna)，诸如选自由受限的乙基核苷(cet)和β-d-氧基-lna组成的组的lna核苷。

22、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与actl6b前体mrna序列至少75％，诸如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补。

23、在其他实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与actl6b前体mrna完全互补。

24、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以不包含多于3个或多于4个连续dna核苷的区域，并且可能无法介导rna酶h切割。

25、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂中的一者或多者或全部核苷间键可以是经修饰的。例如，经修饰的核苷间键可以包含硫代磷酸酯键。

26、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以与至少一个缀合物部分共价附接。

27、在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以呈药用盐诸如钠盐或钾盐的形式。

28、在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

29、在另一方面，提供了一种用于增加细胞中actl6b表达的方法，诸如体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用以有效量的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物，该细胞可能表达异常或表现出耗竭水平的tdp-43。

30、在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病的方法，其包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

31、在另一方面，提供了用作药物的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

32、在另一方面，提供了用于治疗或预防受试者的疾病的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

33、在另一方面，提供了用于制备治疗或预防受试者的疾病的药物的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

34、在本发明的所有方面，该疾病可以是选自由以下项组成的组的神经系统疾患：肌萎缩侧索硬化症(als)、额颞叶变性(ftld)、进行性核上麻痹(psp)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

35、在特定实施例中，该疾病可以是选自由肌萎缩侧索硬化(als)和额颞叶变性(ftld)组成的组的神经系统疾患。