一种基于GelRed染料的细菌活性评估方法

本发明涉及细菌活性评估，具体涉及一种基于gelred染料的细菌活性评估方法。

背景技术：

1、细菌活性评估在细菌检测和抗菌药物开发等领域起着重要的作用，平板计数法被认为是评价细菌活性的标准方法，该方法将细菌通过涂布均匀分布在固体培养基上，单细菌通过分裂繁殖，最终在固体培养基上形成分散的用肉眼可见的菌落。平板计数法需要耗费大量器材、试剂和时间，此外，菌落计数可能会受到不同培养条件的影响，温度和细胞生长率都可能导致的随机误差增大。

2、在过去的二十年里，科学家们不断尝试发展快速高效地区分细菌死活的方法，包括电子显微镜、实时荧光定量pcr(qpcr)、表面增强拉曼光谱、聚集诱导发光(aie)、荧光染色与荧光光谱、光学显微镜或者流式细胞术(fcm)相结合等方法。这些技术很难同时满足高灵敏度和快速检测的要求，如荧光光谱很难准确测定抗生素作用后的细菌死亡率。fcm作为一种快速、高通量的方法，很难检测低于10％的细菌死亡率，尽管近期开发的高灵敏度fcm可以将这一检测限降低到2％-5％，但还是难以满足灵敏度和快速检测的要求。

3、同时各种各样的荧光染料也被使用以提高识别活/死细菌的灵敏度,如碘化丙啶(pi，propidium iodide)、双醋酸酯和rhodamine。其中，pi是最广泛使用的染料，pi只渗透损坏的细菌膜,并用红色荧光染色dna，达到选择性地染色死细胞的效果，但pi存在高背景噪音和低灵敏度的问题，且是一种对哺乳动物细胞有毒的试剂。

4、目前,像gelred、sybrsafe和syto 9这些的安全核酸染料已经被开发并在dna凝胶电泳中广泛应用，gelred对比pi染料具有高灵敏度和低毒性的特点，尚未有关于使用gelred进行细菌染色的报道。

5、综上，亟需一种能够低毒、高效和高灵敏度检测细菌活性的方法。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的上述缺陷，提供一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，能够快速、高效、高灵敏度区分细菌死活，并且使用的材料低毒、安全性高，检测操作简单。

2、为实现本发明目的所采用的技术方案为：

3、一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，包括以下步骤：

4、(1)将金属离子与细菌样品混合后，静置一定时间，得混合细菌溶液；

5、(2)再将混合细菌溶液中加入gelred染料混合均匀后静置一定时间；

6、(3)将步骤(2)的混合细菌溶液加超纯水离心，弃上清液，再加入syto9溶液混合；

7、(4)将步骤(3)的混合细菌溶液使用荧光光度计进行检测。

8、优选地，在步骤(1)中，所述金属离子为mg2+，其终浓度为10mm以上。

9、优选地，在步骤(1)中，静置时间为10-15分钟。

10、优选地，在步骤(2)中，静置时间为20-30分钟。

11、优选地，在步骤(2)中，所述gelred染料的浓度为0.1μg ml-1以上。

12、优选地，在步骤(3)中，加超纯水离心8000g、5-8分钟。

13、优选地，在步骤(3)中，syto9溶液的终浓度为1μm以上。

14、本发明还提供一种基于gelred染料的细菌活性评估方法在细菌检测领域的应用，所述应用含有权利要求1所述基于gelred染料的细菌活性评估方法。

15、本发明另外提供一种基于gelred染料的细菌活性评估方法在抗菌药物开发领域的应用，所述应用含有权利要求1所述基于gelred染料的细菌活性评估方法

16、采用上述技术方案，本发明具有以下技术效果和优点：

17、(1)高灵敏度：本发明使用高浓度金属离子与细菌样品混合反应一段时间，从而降低细菌表面对染料的吸附作用，达到降低背景噪音，结合gelred染料和syto 9建立的荧光比率法能够有效地检测低比率的死菌样品，能检测到0.1％的死细菌，比高灵敏度fcm的检测限2％-5％的灵敏性还高2个数量级。

18、(2)快速：本发明通过将细菌样品与高浓度金属离子混合反应，再加入gelred染料反应后，加入超纯水离心后，加入syto9溶液混匀，使用荧光光度计进行检测，操作步骤简单、快速，对实验人员要求低。

19、(2)低毒性：gelred染料是具有高灵敏、低毒性和超稳定的荧光核酸胶凝染色试剂，其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染，gelred染料对哺乳动物的伤害比pi的小，属于相对安全的染料，降低染料对实验人员的伤害。

技术特征：

1.一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述金属离子为mg2+，其终浓度为10mm以上。

3.根据权利要求1所述一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，其特征在于，在步骤(1)中，静置时间为10-15分钟。

4.根据权利要求1所述一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，其特征在于，在步骤(2)中，静置时间为20-30分钟。

5.根据权利要求1所述一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述gelred染料的浓度为0.1μg ml-1以上。

6.根据权利要求1所述一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，其特征在于，在步骤(3)中，加超纯水离心8000g、5-8分钟。

7.根据权利要求1所述一种基于gelred染料的细菌活性评估方法，其特征在于，在步骤(3)中，syto9溶液的终浓度为1μm以上。

8.一种基于gelred染料的细菌活性评估方法在细菌检测领域的应用，其特征在于，所述应用含有权利要求1所述基于gelred染料的细菌活性评估方法。

9.一种基于gelred染料的细菌活性评估方法在抗菌药物开发领域的应用，其特征在于，所述应用含有权利要求1所述基于gelred染料的细菌活性评估方法。

技术总结本发明公开了一种基于GelRed染料的细菌活性评估方法，先将金属离子与细菌样品混合后，静置一定时间，得混合细菌溶液，再将混合细菌溶液中加入GelRed染料混合均匀后静置一定时间后；加超纯水离心，弃上清液，再加入syto9溶液混合；最后使用荧光光度计进行检测。本发明评估方法具有高灵敏度、快速和低毒性的特点。技术研发人员：何盛斌,陈雅婧,陈泉志受保护的技术使用者：广西医科大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20