一种预测或评估抗IL-4Rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的生物标志物、应用和方法

本发明涉及免疫分析，具体而言，涉及一种预测抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效生物标志物和应用。

背景技术：

1、目前，全世界有4％的人口患有慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitiswith nasal polyps,crswnp)，其治疗仍然是一个临床挑战。其中嗜酸型慢性鼻窦炎伴鼻息肉(eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps,ecrswnp)是难治性crswnp中复发率最高的内在型。

2、il-4是2型炎性反应的信号转导的关键驱动因素，th2细胞通过il-4细胞因子导致嗜酸性粒细胞分化，il-4细胞因子与il-4rα受体，激活细胞内信号转导通路上的转录因子，引起2型炎症反应。作为靶向2型因子的生物制剂，抗il-4rα单抗(例如：dupilumab或cm310)是一种以il-4rα为靶点的完全人源化单克隆抗体，通过阻断il-4rα与il-4的结合从而抑制其生物活性，抗il-4rα单抗因其优异的疗效和安全性已获得美国食品药品监督管理局和美国药品监督管理总局的批准用于治疗crswnp。但临床应用中发现，仍有部分患者经过此类单抗治疗疗效欠佳，且该类药物价格昂贵，并且可作为预测抗il-4rα单抗反应的生物标志物较少。在使用抗il-4rα单抗(例如：dupilumab或cm310)治疗的临床研究中，并没有观察到血液中嗜酸性粒细胞具有统计学意义的改变，血液中嗜酸性粒细胞浸润尚不能作为抗il-4rα单抗有效的生物标志物。

3、因此，探究可预测其疗效的指标实现精准治疗至关重要，本研究旨在探索可用于预测抗il-4 rα单抗疗效的指标。

技术实现思路

1、本发明首先提供了一种预测或评估抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的生物标志物，所述标志物为鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化的指标，所述指标任选地为ecp+细胞数量/hpf。

2、本发明还提供了一种权利要求1所述的标志物的应用，所述应用为a)制备预测或评估抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的检测试剂；或b)制备或评估预测抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的检测试剂盒；或c)用于预测或评估抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的方法，所述方法任选地用于非诊断目的或者非治疗目的。

3、本发明还提供了鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化指标的检测试剂在制备用于预测或评估抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的试剂盒中的应用。

4、优选的，检测试剂包括样本预处理试剂和用于检测鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润和活化指标的试剂；

5、优选的，所述鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化指标的检测试剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：苏木精和伊红(h&e)染色、多重免疫荧光染色、免疫组化染色。

6、所述样本为鼻分泌物、鼻脱落细胞和鼻息肉组织。

7、本发明还提供了一种预测或评估抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的方法，所述方法任选地用于非诊断目的或者非治疗目的，其包含检测鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化指标的步骤，所述指标任选地为ecp+细胞数量/hpf，并且以鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化指标结果来预测或评估抗il-4 rα单抗疗效。

8、优选的，所述检测鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化指标的步骤包括适用于如下至少一种方法：苏木精和伊红(h&e)染色、多重免疫荧光染色、免疫组化染色。

9、优选的，所述苏木精和伊红(h&e)染色包括：将息肉组织在含有1％青霉素、1％链霉素和1％两性霉素的pbs中冲洗，称量后切成重量约0.1g的小切片，将工作浓度10μg/μl，体积10μl的il-4或pbs分别注射至每个所述的小切片，与获得息肉的同一受试者分离的白细胞共培养96小时(每孔100万个细胞)，在苏木精和伊红(h&e)染色后评估组织中嗜酸性粒细胞浸润程度。

10、优选的，通过多重免疫荧光染色方法评估鼻息肉基线组织中每高倍镜视野(perhigh power field,hpf)下ecp+细胞、ecp+cd63+细胞和ecp+cd69+细胞的数量。从福尔马林固定的石蜡包埋组织中切下厚度为4μm的切片，在二甲苯中去石蜡化，并通过分级醇系列再水化。使用乙二胺四乙酸(edta，dako，s2367)或ar6缓冲液(ar600125ml，akoya biosciences)进行抗原回收(微波炉，120℃，20分钟)。使用opal 6-plex手动检测试剂盒(nel811001kt，akoya biosciences)进行多重免疫荧光染色。蛋白质阻断(ard1001ea，akoyabiosciences)后，在37℃下依次应用一级抗体孵育40分钟，然后二级抗体孵育10分钟，随后通过酪胺信号放大技术和opal荧光检测10分钟。嗜酸性粒细胞的多重免疫荧光标记物的评估包括：嗜酸性阳离子蛋白(ecp，ab207429，1:4000)、cd63(za-0694，未稀释)、cd69(ab233396，1:1000)。在每一轮检测之后，使用抗原回收缓冲液进行热诱导的表位回收。在最后一轮免疫荧光染色后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，akoya biosciences，fp1490)孵育5分钟。使用prolong gold antifade(thermofisher scientific，p36935)安装盖玻片。使用vectra polaris多光谱成像系统(akoya biosciences)获得40倍镜下多光谱图像的代表性区域。用单色和未染色切片作对照生成光谱库后使用inform软件包(akoyabiosciences，v2.6)进行多光谱解混。

11、优选的，采用nps评分将抗il-4 rα单抗治疗后nps较基线nps变化是否大于等于2分将受试者分为应答组和无应答组。0分：无息肉；1分：中鼻道可见小息肉，大小未超过中鼻甲下缘；2分：息肉达到中鼻甲下缘；3分：息肉至下鼻甲下缘，或评分为2的息肉同时伴有中鼻甲内侧的大息肉；4分：息肉完全或者接近完全堵塞鼻腔，即至鼻底。两侧nps评分之和即为最终得分。

12、本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：

13、本发明发现了鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化的指标作为预测抗il-4 rα单抗疗效生物标志物的应用，具体是使用ecp+细胞数量/hpf预测患者对抗il-4 rα单抗治疗应答的roc曲线显示auc＝0.909，敏感度为86.7％，特异度为75％，本发明的标志物可以快速、准确的预测或评估抗il-4 rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效，填补了现有技术的空白，具有重大的临床价值和经济价值。

技术特征：

1.一种预测或评估抗il-4rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的生物标志物，其特征在于所述标志物为鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化的指标，所述指标任选地为ecp+细胞数量/hpf。

2.一种权利要求1所述的标志物的应用，其特征在于，所述应用为a)制备预测或评估抗il-4rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的检测试剂；或b)制备或评估预测抗il-4rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的检测试剂盒；或c)用于预测或评估抗il-4rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的方法，所述方法任选地用于非诊断目的或者非治疗目的。

3.一种权利要求1所述的标志物的检测试剂在制备用于预测或评估抗il-4rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的检测试剂在制备用于预测或评估抗il-4rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂包括样本预处理试剂和用于检测鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润和活化指标的试剂；所述样本为鼻分泌物、鼻脱落细胞和鼻息肉组织。

5.一种预测或评估抗il-4rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的方法，其特征在于，所述方法任选地用于非诊断目的或者非治疗目的，其包含检测鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化的指标的步骤，所述指标任选地为ecp+细胞数量/hpf，并且以鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化的指标结果来预测或评估抗il-4rα单抗疗效。

6.根据权利要求2-4所述的应用，其特征在于，所述鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化指标的检测试剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：苏木精和伊红(h&e)染色、多重免疫荧光染色、免疫组化染色。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化的指标的步骤包括适用于如下至少一种方法：苏木精和伊红(h&e)染色、多重免疫荧光染色、免疫组化染色。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述苏木精和伊红(h&e)染色包括：将息肉组织在含有1％青霉素、1％链霉素和1％两性霉素的pbs中冲洗，称量后切成重量约0.1g的小切片，将工作浓度10μg/μl，体积10μl的il-4或pbs分别注射至每个所述的小切片，与获得息肉的同一受试者分离的白细胞共培养96小时(每孔100万个细胞)，在苏木精和伊红(h&e)染色后评估组织中嗜酸性粒细胞浸润程度。

技术总结本发明公开了鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润和活化的指标作为预测或评估抗IL‑4Rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效的生物标志物以及应用和方法，具体是使用ECP<supgt;+</supgt;细胞数量/HPF作为标志物进行检测，最后使用验证集的ROC曲线显示AUC＝0.909，敏感度为86.7％，特异度为75％，本发明的标志物可以快速、准确的预测或评估抗IL‑4Rα单抗在治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉中疗效，填补了现有技术的空白，具有重大的临床价值和经济价值。技术研发人员：张罗,王成硕,闫冰,张媛,申珅,羡慕,王梦琳受保护的技术使用者：首都医科大学附属北京同仁医院技术研发日：技术公布日：2024/8/20