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肠杆菌素合酶编码基因在发酵生产丝氨酸中的应用的制作方法

  • 国知局
  • 2024-08-22 15:08:46

本发明涉及基因工程及发酵工程,具体地,涉及一株丝氨酸生产菌株的基因工程改造以及利用其发酵生产丝氨酸的方法。

背景技术:

1、 l-丝氨酸( l- serine)属于非必需氨基酸,在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着重要作用,参与细胞膜的制造、肌肉组织和神经鞘的合成等生命活动,被广泛地应用于食品、医药、化妆品等领域,具有重要的商业价值。目前, l-丝氨酸的主要生产方法有酶转化法、蛋白质水解法、化学合成法等。但是这些方法有成本高、产量少、造成环境污染的特点,不适用于大规模的产业化生产。而微生物发酵法可以克服以上问题,是一种绿色环保可持续的生产方法,逐渐成为现今和未来 l-丝氨酸生产的热点。

2、大肠杆菌,由于其遗传背景较为清晰,易于培养,是生产氨基酸的重要工程菌株之一,通过传统代谢工程获得以大肠杆菌为微生物底盘的 l-丝氨酸生产菌株的技术已相对成熟。现有技术中,针对 l-丝氨酸生物合成的代谢工程主要集中于强化合成途径关键酶、过表达及突变限速酶、抑制竞争途径和强化 l-丝氨酸胞外转运途径。例如,cn 115838683a公开了一种改造 l-丝氨酸合成模块、降解模块、转运模块和副产物合成模块的大肠杆菌基因工程菌,并以此提高其 l-丝氨酸耐受性的方法。

3、近年来,为进一步提高 l-丝氨酸产量,常采用传统诱变或适应性进化的方法对上述通过代谢工程获得的 l-丝氨酸生产菌株进行非理性改造。但是,传统诱变或适应性进化的方法具有不确定性强、工作量大、周期长等缺陷。基于微生物代谢系统的复杂性,尽管 l-丝氨酸生产菌株的代谢途径被逐步地解析,但由于缺乏 l-丝氨酸生物合成与其他细胞物质代谢之间联系的深入了解, l-丝氨酸产量难以进一步提升,因此需要挖掘更多的未知基因靶点来寻求突破传统 l-丝氨酸代谢途径的限制,以期提高微生物发酵法生产 l-丝氨酸的产量和糖酸转化率等重要生产指标。

4、crispr干扰技术(clustered regularly interspaced palindromic repeatsinterference, crispri)通过在核酸酶催化残基中引入点突变,从而设计出一种催化活性部分失活的cas9蛋白(dcas9),这些突变使cas9内切酶不能切断双链dna,但允许使用rna进行引导,在sgrna的作用下,dcas9蛋白可精确定位目标靶点,空间上阻碍rna聚合酶(rnapolymerase, rnap)的转录过程,实现特定基因的表达下调。该技术可用于高通量的功能基因筛查,从而实现解析微生物代谢网络结构的能力,已经广泛应用于微生物代谢工程增强所需产物的生物合成。

技术实现思路

1、为打破对丝氨酸生产菌株进行理性化分子改造所存在的局限性,同时也为了解决目前微生物发酵法生产丝氨酸的产量较低以及转化率不高等问题,本发明借助crispri技术对 l-丝氨酸生产菌株中可能存在的非传统 l-丝氨酸代谢途径中的潜在靶点基因进行筛选,选择中心碳代谢模块和相关副产物途径中的38个基因作为目标基因,利用crispri系统构建筛选体系,筛选出影响 l-丝氨酸合成的非传统 l-丝氨酸代谢途径的有效抑制靶点 entb、 entd、 ente、 entf。这四个基因的表达产物组成肠杆菌素合酶(enterobactinsynthase),在肠杆菌素的合成过程中扮演重要角色。

2、将大肠杆菌的 entb、 entd、 ente、 entf基因分别敲除后得到突变菌株-δ entb、突变菌株-δ entd、突变菌株-δ ente和突变菌株-δ entf,其发酵生产 l-丝氨酸的产量和转化率均大大提高。基于敲除筛选出的新靶点 entb、 entd、 ente、 entf构建的 l-丝氨酸生产菌株及利用其发酵生产 l-丝氨酸的方法,突破了传统的理性化分子改造的局限性,为微生物发酵法生产 l-丝氨酸提供了新的思路。

3、本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因在发酵生产 l-丝氨酸中的应用,所述肠杆菌素合酶编码基因选自  entb、 entd、 ente、 entf,所述 entb的核苷酸序列如seq id no:1所示,所述 entd的核苷酸序列如seq id no:2所示,所述 ente的核苷酸序列如seq id no:3所示,所述 entf的核苷酸序列如seq id no:4所示。

4、本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因 entb在发酵生产 l-丝氨酸中的应用,所述 entb的序列如seq id no:1所示。

5、本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因 entd在发酵生产 l-丝氨酸中的应用,所述 entd的序列如seq id no:2所示。

6、本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因 ente在发酵生产 l-丝氨酸中的应用,所述 ente的序列如seq id no:3所示。

7、本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因 entf在发酵生产 l-丝氨酸中的应用,所述 entf的序列如seq id no:4所示。

8、本发明提供一种用于发酵生产 l-丝氨酸的突变菌株,其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因抑制或敲除后而得到的,所述肠杆菌素合酶编码基因选自 entb、 entd、 ente、 entf,所述 entb的序列如seq id no:1所示,所述 entd的序列如seq id no:2所示,所述 ente的序列如seq id no:3所示,所述 entf的序列如seq id no:4所示。

9、本发明提供一种用于发酵生产 l-丝氨酸的突变菌株,其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因 entb抑制或敲除后而得到的突变菌株-δ entb,优选对 entb进行敲除处理。

10、本发明提供一种用于发酵生产 l-丝氨酸的突变菌株,其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因 entd抑制或敲除后而得到的突变菌株-δ entd,优选对 entd进行敲除处理。

11、本发明提供一种用于发酵生产 l-丝氨酸的突变菌株,其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因 ente抑制或敲除后而得到的突变菌株-δ ente,优选对 ente进行敲除处理。

12、本发明提供一种用于发酵生产 l-丝氨酸的突变菌株,其是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因 entf抑制或敲除后而得到的突变菌株-δ entf,优选对 entf进行敲除处理。

13、本发明提供一种发酵生产 l-丝氨酸的方法,其是利用上述突变菌株-δ entb进行发酵。

14、本发明提供一种发酵生产 l-丝氨酸的方法,其是利用上述突变菌株-δ entd进行发酵。

15、本发明提供一种发酵生产 l-丝氨酸的方法,其是利用上述突变菌株-δ ente进行发酵。

16、本发明提供一种发酵生产 l-丝氨酸的方法,其是利用上述突变菌株-δ entf进行发酵。

17、本发明提供一种肠杆菌素合酶编码基因在促进l-丝氨酸发酵生产中的用途,所述促进l-丝氨酸发酵生产是通过抑制或敲除微生物的肠杆菌素合酶编码基因实现的,所述肠杆菌素合酶编码基因选自entb、entd、ente或entf。

18、本发明提供一种促进l-丝氨酸发酵生产的方法,抑制或敲除微生物的肠杆菌素合酶编码基因,所述肠杆菌素合酶编码基因选自entb、entd、ente或entf。

19、本发明提供一种提高大肠杆菌l-丝氨酸产量的方法,抑制或敲除大肠杆菌中的肠杆菌素合酶编码基因,所述肠杆菌素合酶编码基因选自entb、entd、ente或entf。

20、本发明提供一种具有提高的l-丝氨酸产量的突变菌株,其特征在于,是将大肠杆菌的肠杆菌素合酶编码基因抑制或敲除后而得到的,所述肠杆菌素合酶编码基因选自entb、entd、ente或entf。

21、本发明还提供突变菌株在发酵生产丝氨酸中的用途。

22、本发明提供一种发酵生产l-丝氨酸的方法,使用上述突变菌株发酵制备丝氨酸。

23、上述发酵生产 l-丝氨酸的方法,具体地以上述突变菌株作为生产菌株,先进行种子培养,再接种到发酵罐中进行 l-丝氨酸发酵培养。

24、所述种子培养基组成为:葡萄糖10-50 g/l、磷酸二氢钾1-5 g/l、酵母浸粉2-10g/l、蛋白胨1-5 g/l、硫酸铵1-5 g/l、柠檬酸1-5 g/l、硫酸镁0.5-1 g/l、一水合硫酸锰1-5mg/l、vb1 0.5-3 mg/l、vh 1-5 mg/l、氯化钴1-5 mg/l、硫酸锌1-5 mg/l、消泡剂0.1-1 ml/l、amp 10-100 µg/ml。

25、所述发酵罐发酵培养基组成:葡萄糖10-50 g/l、磷酸氢二钾5-10 g/l、酵母浸粉2-6 g/l、蛋白胨2-10 g/l、硫酸铵2-6 g/l、玉米浆1-10 g/l、柠檬酸1-5 g/l、硫酸镁1-3g/l、一水合硫酸锰5-20 mg/l、vb1 0.5-3 mg/l、vh 1-5 mg/l、氯化钴1-5 mg/l、硫酸锌1-5mg/l、硫酸铜0.1-1 mg/l、氯化钙2-6 mg/l、消泡剂0.1-1 ml/l、amp 10-100 µg/ml。

26、所述种子培养,接种量为0.5-1.0%,培养温度为35-40 ℃,ph控制在6.5-7.5,溶氧控制在10-30%,残糖控制在0.1-0.3%,培养周期为10-15 h。

27、所述发酵罐中 l-丝氨酸发酵培养,接种量为10-15%,培养温度为35-40 ℃,ph控制在6.5-7.5,溶氧控制在10-30%,残糖控制在0.1-0.3%,发酵周期为45-55h。

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