一种卵清蛋白-茶多酚共价接枝物及其制备方法

本发明属于食品、日化、医药，具体涉及一种卵清蛋白-茶多酚共价接枝物及其制备方法。

背景技术：

1、我国是全球最大的鸡蛋生产国，产量占据全球产蛋总量的30％以上。卵清蛋白(ova)在鸡蛋蛋清中的含量高达56％，其作为一种天然健康的安全乳化剂，可用于改善水包油(o/w)乳液的氧化稳定性。近年来，许多研究表明多酚可以以非共价或者共价形式对蛋白进行修饰形成蛋白-多酚复合物，从而提高蛋白质的抗氧化特性。这些结果凸显出ova应用为抗氧化型乳化剂的可能性。

2、茶叶中的儿茶素属于黄烷醇类化合物，是多酚类物质的主体成分。其中的单体之一表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)的含量最高，占儿茶素80％。茶多酚具有多个酚羟基结构，有较强的氧自由基清除能力，可抑制脂质的过氧化反应。ova和茶多酚之间的共价相互作用导致蛋白质上引入了更多的茶多酚羟基，从而提高了蛋白质的抗氧化活性。

3、自由基接枝法是制备卵清蛋白-茶多酚复合物的常用技术手段，采用过氧化氢/抗坏血酸体系作为自由基引发剂，制得的共价产物相对稳定，且操作简便，环境友好。然而，在传统自由基接枝反应中，蛋白质侧链氨基酸产生的自由基会优先与茶多酚上解离能最低的邻位酚羟基发生氧化还原反应，从而无法最大限度地保留茶多酚的抗氧化活性，导致制得的卵清蛋白-茶多酚复合物抗氧化性能大大降低。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种卵清蛋白-茶多酚共价接枝物及其制备方法，该制备方法采用新的制备手段，即先将茶多酚(egcg)上的活性基团进行保护后，再将其与卵清蛋白进行自由基接枝，随后在酸性条件下脱去保护基。此方法能够有效保留茶多酚活性基团，提高接枝产物的抗氧化活性；且该方法工艺简便易操控，制得的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物可用作抗氧化型乳化剂，有利于提高载体的氧化稳定性。

2、一种卵清蛋白-茶多酚共价接枝物的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)将表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)溶于反应溶剂后加入原丙酸三甲酯和酸性催化剂进行定向反应，反应结束后得到定向保护物；

4、(2)氮气保护下，依次向卵清蛋白溶液中加入过氧化氢和抗坏血酸，室温下搅拌1～2h；后加入定向保护物继续反应，反应结束后反应液经透析、冷冻、干燥得邻位酚羟基被保护的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物；

5、(3)将邻位酚羟基被保护的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物溶于脱保护溶剂并加酸进行脱保护反应，即得所述卵清蛋白-茶多酚共价接枝物。

6、上述步骤(1)中：

7、作为优选，表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)与原丙酸三甲酯的摩尔比为1:(5～30)。该比例有助于原料的充分转化，使得特定位点的活性羟基被充分屏蔽。作为进一步优选，表没食子儿茶素没食子酸酯与原丙酸三甲酯的摩尔比为1:(10～25)。更进一步优选为1:(15～25)。更具体地优选为1:(15～20)。在提高了原料反应速率和选择性的同时，减少了副产物的生成。

8、作为优选，酸性催化剂为三氟甲磺酸镁、三氟甲磺酸钙、三氟甲磺酸锌、对甲苯磺酸中的一种或多种。酸性催化剂的加入可以加快反应的进行。

9、为提高反应选择性，进一步优选为酸性较强的三氟甲磺酸镁或三氟甲磺酸钙。

10、作为优选，表没食子儿茶素没食子酸酯与酸性催化剂的摩尔比为1:(0.01～1)。更进一步优选为1:(0.1～0.5)。

11、作为优选，反应溶剂为二氯甲烷、甲苯、乙腈、四氢呋喃中的一种或多种。进一步优选为甲苯或乙腈。这两种非质子性溶剂具有出色的溶解性能。

12、作为优选，定向反应温度为0～100℃，反应时间为8～15h。进一步优选为，定向反应温度为室温～50℃，反应时间为10～15h。更进一步优选为，定向反应温度为35～45℃，反应时间为10～12h。

13、作为优选，定向反应结束后，将反应产物用乙酸乙酯萃取，经色谱纯化后得表没食子儿茶素没食子酸酯的定向保护物。

14、上述步骤(2)中：

15、作为优选，卵清蛋白溶液由卵清蛋白溶于水中制备得到，浓度为5～15mg/ml。进一步优选为8～12mg/ml。更进一步优选为10mg/ml。

16、作为优选，卵清蛋白与定向保护物的质量比为(1～5)：1。进一步优选为(2～3)：1。更进一步优选为(2.2～2.5)：1。

17、作为优选，过氧化氢以其水溶液的形式进行添加，其中，过氧化氢的摩尔量与卵清蛋白的质量比为(0.5～1.5)mmol/100mg。进一步优选为(0.8～1.2)mmol/100mg。更进一步优选为1mmol/100mg。

18、作为优选，卵清蛋白与抗坏血酸的质量比为(2～6)：1。进一步优选为(3～5)：1。更进一步优选为4:1。

19、作为优选，加入定向保护物后继续反应15～30h。进一步优选为20～28h。更进一步优选为24h。

20、上述步骤(3)中：

21、作为优选，酸为有机酸或无机酸。其中，无机酸为盐酸、硫酸、磷酸中的一种；有机酸为三氟乙酸或对甲苯磺酸。作为进一步优选，酸为三氟乙酸或对甲苯磺酸。这些试剂(酸)通常对特定保护基有较高选择性，能够在短时间内完成脱保护反应，提高合成效率。

22、作为优选，脱保护溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。进一步优选为甲醇或乙醇。这两种溶剂相对温和、低毒，易于获取且成本较低。更进一步优选为甲醇。

23、作为具体优选，将邻位酚羟基被保护的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物溶于三氟乙酸/甲醇体积比为1:10的溶液中室温下进行脱保护反应1h，得所述卵清蛋白-茶多酚共价接枝物。

24、本发明还提供一种卵清蛋白-茶多酚共价接枝物，由上述任一项所述的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物的制备方法制备得到。本发明的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物具有优良的抗氧化能力。

25、本发明的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物的制备方法，包括：采用原丙酸三甲酯作为保护剂屏蔽茶多酚(egcg)邻位活性酚羟基；再利用过氧化氢/抗坏血酸氧化还原对卵清蛋白引发自由基接枝反应；后产物在使用前经脱保护及后处理得到卵清蛋白-茶多酚共价接枝物。本发明的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物具有优良的抗氧化能力。本发明的卵清蛋白-茶多酚共价结合物解决了在接枝过程中无法充分保留活性酚羟基的技术难题。本发明提供的新型接枝方法高效易行，适用于大规模、工业化生产，能广泛应用于食品、日化、医药领域。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

27、本发明的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物的制备方法，先利用原丙酸三甲酯对表没食子儿茶素没食子酸酯(ecgc)的邻位酚羟基进行保护，再将受保护ecgc与卵清蛋白进行自由基接枝，得到了邻位酚羟基被保护的卵清蛋白-茶多酚共价接枝物，对其进行脱除保护基，即可得到卵清蛋白-茶多酚共价接枝物。经过该方法能够有效保护自由基接枝过程中的邻位酚羟基，最大程度保证产物卵清蛋白-茶多酚共价接枝物抗氧化性能。该方法工艺简单，高效易行，易于实现规模化生产，能广泛应用于食品、日化、医药领域。