制备可释放聚合物试剂的方法与流程

本技术涉及(除其他之外)制备基于芴基的聚合物试剂的改进方法、回收和纯化此类聚合物试剂的方法、减少基于芴基的聚合物试剂中不需要的杂质的方法、通过本文所述的方法制备的基于芴基的聚合物试剂以及通过与经由本文所述的方法制备的基于芴基的聚合物试剂反应制备的缀合物。

背景技术：

1、通过聚乙二醇的共价附接对生物活性分子进行修饰可以增强此类分子的药理和药物性质，并且已成功用于几种批准的药物中。例如，peg化已用于创造其中生物药剂以稳定键共价附接到聚乙二醇的上市药物，诸如例如(peg化肿瘤坏死因子(tnf))、(peg化粒细胞集落刺激因子(gcsf))、(peg化干扰素α-2a)和(peg化因子viii)。在许多情况下，一个或多个聚乙二醇链与活性剂的稳定共价附接导致产生与未修饰的分子相比时功能活性降低的peg缀合物。当活性药物通过稳定的键联共价附接到聚合物时，聚合物结合药物可以保留未结合药物的性质，不过其每克药物的功效通常不同于未修饰药物，因为共价附接的聚合物可改变药物分子周围的空间和电子环境等，并且可使药物有效性降低(以每克药物计)。然而，此种影响在某些情况下可以通过例如更长的循环时间来抵消，使得可以实现增强的药物功效。

2、还存在其中peg试剂通过可释放的键联共价附接到治疗剂的peg化技术。可释放的peg化(在一些情况下也称为“可逆的peg化”)是一种技术，其中活性剂缀合物(包括可释放地化学键合到一个或多个水溶性聚合物部分诸如聚乙二醇的药物分子)在施用后，通过体内发生的化学过程，随时间从药物中释放一个或多个聚合物部分。此类可释放地聚合物修饰的药物有时称为前药，因为在理论上，一个或多个聚合物在循环中随时间被释放，并且母体药物分子的活性可得以恢复。可释放药物递送系统的功效可受例如来自药物缀合物的一个或多个共价附接的聚合物部分的释放速率的影响。

3、可用于形成能够经历可逆(可释放)peg化的药物缀合物的一类peg化试剂是基于芴基甲氧基羰基(fmoc)胺保护基(参见例如，wuts,p.g.,greene,t.w.,protective groupsin organic synthesis[有机合成中的保护基],第4版,2007,john wiley&sons,inc.,newjersey；bentley,m.d.,等人,美国专利号8,252,275；shechter y.,等人,eur j pharmbiopharm[欧洲制药学与生物制药学杂志],2008,70,19-28)。下面的结构x中示出了这些试剂的一个特定类别(本文称为聚合物fmoc试剂，或在一些特定情况下称为peg化fmoc试剂)的具有支化架构的一般化结构(如描述于例如bentley,m.d.,等人,美国专利号8,252,275中，通过引用以其全文结合在此，其中提供了对l1和l2以及re1和re2的描述)。在此说明性结构中，聚合物试剂被活化为n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)碳酸酯，即，包含琥珀酰亚胺基碳酸酯离去基团。

4、

5、peg2 fmoc试剂可与包含能够与fmoc型试剂反应以形成例如氨基甲酸酯加合物的亲核原子的治疗剂反应。下面展示了此反应方案，作为实例，示出蛋白质赖氨酸基团与包含反应性n-琥珀酰亚胺基碳酸酯基团的示例性peg2-fmoc试剂的一般化形式的反应(方案i)。

6、

7、在通过先前描述的合成方法制造各种fmoc试剂期间，申请人经历了不想要的副反应。这些副反应可导致形成不希望的副产物，这些副产物(i)可潜在地对最终聚合物-治疗剂缀合物的质量产生不利影响，并且(ii)可改变fmoc聚合物部分(或多个部分)从治疗剂中释放的机理。本披露描述了与先前描述的制备主题聚合物fmoc试剂的方法相关联的挑战，并且提供了旨在克服此类问题的若干工艺改进，从而提供例如制备聚合物fmoc试剂的改进方法、用于制备可用于制备聚合物fmoc试剂的中间体的改进方法、用于活化fmoc中间体的改进方法、用于去除一种或多种不希望的聚合物fmoc衍生的副产物或杂质的方法以及用于稳定某些聚合物fmoc试剂的方法等。因此，本披露寻求解决与制备主题聚合物fmoc试剂及其缀合物相关的这些和其他挑战。

技术实现思路

1、在第一方面中，本文提供一种用于制备反应性聚合物试剂的方法，即改进的方法。该方法包括(i)使具有结构(i)的水溶性9-羟甲基芴聚合物：

2、

3、其中polya是第一水溶性非肽聚合物；polyb是第二水溶性非肽聚合物；当存在时，re1是第一电子改变基团；并且当存在时，re2是第二电子改变基团；l1是第一连接部分；并且l2是第二连接部分；

4、在无水条件下，在碱存在下在非质子有机溶剂中与二苯并三唑基碳酸酯(btc)反应，以提供包含具有以下结构的水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物的反应混合物：

5、

6、其中polya、polyb、re1、re2、l1和l2各自具有如步骤(i)中所述的值，以及(ii)通过用有效促进水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物沉淀的无水溶剂沉淀来回收水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物(ii)。

7、在与该方法相关的一个或多个实施例中，在步骤(i)中，使具有结构(i)的水溶性9-羟甲基芴聚合物与少于约30当量的二苯并三唑基碳酸酯(di-btc)反应。

8、在一些实施例中，碱是胺。在一些进一步的实施例中，碱是非亲核胺或弱亲核胺。碱包括例如，吡啶、4-二甲氨基吡啶、n,n-二异丙基乙胺、2,6-二叔丁基吡啶、n-甲基咪唑、n-甲基吗啉、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、n,n,2,6-四甲基吡啶-4-胺和前述中的任一种的不可溶聚合物结合形式。胺也可以是多胺，诸如例如n,n,n’,n’-四甲基-1,6-六甲基二胺、n,n’,n’,n”,n”-五甲基二亚乙基三胺和六亚甲基四胺。

9、在方法的一个或多个实施例中，在步骤(ii)中，有效促进沉淀的无水溶剂进一步包含酸。

10、在一些进一步的实施例中，方法进一步包括在反应步骤之前，将具有结构(i)的水溶性9-羟甲基芴聚合物溶解在非质子有机溶剂中以形成聚合物溶液，以及通过共沸蒸馏干燥聚合物溶液以提供具有小于约500ppm的含水量的聚合物溶液。

11、在一些另外的实施例中，从步骤(ii)回收的水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物包含小于10摩尔百分比的水溶性富烯聚合物。

12、在方法的一些其他实施例中，回收步骤包括过滤来自步骤(i)的反应混合物以去除固体，以提供包含水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物的溶液，之后添加有效地从溶液中沉淀水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物的一定量的无水溶剂。

13、在一些另外的实施例中，有效促进水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物沉淀的无水溶剂包含少量酸。

14、在一些进一步的实施例中，方法包括用无水溶剂洗涤回收的水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物，在该无水溶剂中水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物是不可溶的或基本上不可溶的，该溶剂包含从约0.0001摩尔百分比至约0.5摩尔百分比的酸。

15、在一些进一步的实施例中，方法进一步包括(iii)纯化回收的水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物。

16、在第二方面中，本文提供一种方法，该方法包括在有效进行以下转化的条件下将如上所述的回收或纯化的水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物转化为不同的反应性碳酸酯，诸如例如水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物。在一个或多个说明性实施例中，在二甲氨基吡啶存在下进行此种转化。在一个或多个实施例中，转化反应在诸如例如二氯甲烷的溶剂中进行。

17、在第三方面中，还提供一种用于制备n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯活化的聚合物试剂的方法。该方法包括(i)使具有以下结构的水溶性9-羟甲基芴聚合物：

18、

19、其中polya是第一水溶性非肽聚合物；polyb是第二水溶性非肽聚合物；当存在时，re1是第一电子改变基团；当存在时，re2是第二电子改变基团；l1是第一连接部分；l2是第二连接部分；re1，可能存在或可能不存在，是第一电子改变基团；并且re2，可能存在或可能不存在，是第二电子改变基团，

20、在碱存在下，在无水非质子有机溶剂中与从约1当量至20当量的二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，以提供包含具有以下结构的水溶性9-甲基n-琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物的反应混合物：

21、

22、其中polya、polyb、re1、re2、l1和l2各自具有如步骤(i)中所述的值；以及(ii)从反应混合物中回收具有结构(iii)的水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物。

23、示例性水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物包括以下结构xi-xiv，其中mpego～是甲氧基聚乙二醇或ch3o(ch2ch2o)nch2ch2o-的简写，(不过也可以适当地设想适合于与靶药物分子的官能团反应的多种反应性基团中的任一种，诸如苯并三唑基碳酸酯，也可以设想取代到芴核上的另外的水溶性聚合物链而不是聚乙二醇)，其中每个(n)在从约3至2273的范围内，包括本文别处所述的(n)的每个子范围和特定值，

24、

25、结构(xi)：9-羟甲基-4-(mpeg-羧酰胺)-7-(3-(mpeg氨基甲酰基-丙基)-芴-n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯(“cac-peg2-fmoc-nhs”)

26、

27、结构(xii)：9-羟甲基-2,7-二(mpeg-酰胺基戊二酰胺)芴-n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯(“g2-peg2-fmoc-nhs”)

28、

29、结构(xiii)：9-羟甲基-4-(mpeg-羧酰胺)-7-(mpeg酰胺基戊二酰胺)芴-n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯(“cg-peg2-fmoc-nhs”)

30、以及

31、

32、结构xiv：9-羟甲基-2,7-(双mpeg-羧酰胺)-芴-n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯(“c2-peg2-fmoc-nhs”)。

33、在上述方法的一些实施例中，在反应步骤(i)之前，将水溶性9-羟甲基芴聚合物溶解在无水非质子有机溶剂中以提供聚合物溶液，之后干燥聚合物溶液以去除可能存在的水，以提供具有小于500ppm的含水量的干燥聚合物溶液。

34、在方法的一些进一步的实施例中，重复干燥直到获得具有小于200ppm的含水量的干燥聚合物溶液。

35、在一些另外的特定实施例中，干燥步骤包括共沸蒸馏聚合物溶液。

36、在与前述相关的一些进一步的实施例中，重复干燥直到聚合物溶液的含水量保持恒定。

37、在一个或多个另外的实施例中，方法进一步包括在回收步骤之前，以有效中和碱的量将酸添加到来自步骤(i)的反应混合物中。

38、在一些实施例中，方法有效地产生包含15摩尔百分比或更少的水溶性富烯聚合物的回收的水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物。

39、在方法的一个或多个实施例中，沉淀溶剂处于高于其冰点且低于室温的温度。

40、在一些进一步的实施例中，沉淀溶剂包含少量酸。

41、在一些实施例中，方法进一步包括用酸化的沉淀溶剂洗涤回收的水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物。

42、在一个或多个实施例中，方法进一步包括纯化回收的水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物。

43、在一些另外的实施例中，纯化步骤包括将回收的水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物溶解在溶剂中以提供溶液，使该溶液穿过含硫醇(thiol)树脂以去除任何水溶性富烯聚合物从而提供纯化的溶液，以及从纯化的溶液中去除溶剂以回收纯化的水溶性9-甲基n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯芴聚合物。

44、在一个或多个进一步的实施例中，使回收或纯化的水溶性9-甲基苯并三唑基碳酸酯芴聚合物或通过本文所述方法制备的其他反应性碳酸酯与含胺生物活性剂反应以提供缀合物。

45、在另一方面中，提供溴化的水溶性芴聚合物。在一个或多个实施例中，溴化的水溶性芴聚合物具有选自以下的结构：

46、

47、其中polya、polyb、l1和l2具有如本文别处所述的值。

48、另外的方面和实施例在以下说明书和权利要求书中进行阐述。