一种HaloTag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白及其制备方法和应用与流程
- 国知局
- 2024-10-21 15:01:40
本发明涉及生物,尤其是涉及一种halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术:
1、人表皮生长因子(egf)是一种细胞生长因子,egf是一个53个氨基酸的多肽,asn971-arg1023,分子量约为6kda,能激活egf受体,进而调控多种哺乳动物细胞的生长和分裂,并促进组织生长和再生。以往的研究表明,重组egf蛋白在治疗组织损伤(如皮肤伤口愈合)方面具有巨大潜力。
2、原核表达系统是一种高产且成本效益高的蛋白表达系统。重组egf(rhegf)蛋白在大肠杆菌(e.coli)中表达,但直接表达的rhegf往往以包涵体形式存在,不溶于缓冲溶液,其生物活性也较低[1]。目前有多种使用标签蛋白融合表达的方法用于可溶性蛋白的表达和制备,如硫氧还蛋白、sumo、麦芽糖结合蛋白、halotag、fh8和谷胱甘肽s-转移酶等。国外研究发现,硫氧还蛋白和fh8都能改善rhegf蛋白的可溶性,但其纯化方法需要镍离子亲和层析和凝胶过滤层析的结合,纯化难度较大[2–4]。
3、halotag是一种细菌内表达的卤代烷脱卤酶的改性形式。它与氯代烷配体反应形成共价键,可通过携带氯代烷基团的荧光染料和量子点来标记halotag融合蛋白,进行荧光成像。目前,halotag标签蛋白主要用于目的蛋白的荧光标记和追踪,在改善蛋白的可溶性表达方面的应用相对较少。
4、之前的研究已经证明halotag还能显著提高fgf蛋白如fgf8、fgf17和fgf18的可溶性和产量[4]。此外,halotag蛋白表面有一部分负电荷残基,这使得它能够通过离子交换树脂进行纯化。
5、大肠杆菌表达的重组人表皮生长因子(rhegf)蛋白通常出现在包涵体中,需要通过蛋白去折叠和再折叠的复杂方法进行制备,其操作难度、批次稳定性和生物活性都不能很好的保证。
6、因此,建立一种高效表达和纯化具有活性的rhegf蛋白的新方法对其药物的转化具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的就是为了提供一种halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白及其制备方法和应用。本发明通过基因重组技术设计了halotag标签蛋白与重组人表皮生长因子(rhegf)共表达的融合蛋白(halo-rhegf)质粒载体,并能够运用大肠杆菌大量表达可溶性的halo-rhegf。同时,halotag标签蛋白能够亲密结合阴离子交换树脂,为halo-rhegf蛋白的纯化提供了便利。halotag标签蛋白为rhegf蛋白的可溶性表达和简易纯化提供了可能性,并且为rhegf蛋白的缓释提供了可行性方案。细胞实验结果显示,纯化出的halo-rhegf蛋白具有良好的生物活性,能够显著促进上皮细胞和成纤维细胞的活力,为rhegf蛋白药物的开发提供了新方法。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
3、本发明的第一个目的在于提供一种重组人表皮生长因子,该重组人表皮生长因子(rhegf)的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、本发明的第二个目的在于提供一种halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白,该融合蛋白(halo-rhegf)包括如权利要求1所述的重组人表皮生长因子、halotag标签蛋白和histag片段,
5、如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的氮端插入halotag标签蛋白,所述halotag标签蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示;
6、如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的碳端插入histag片段,所述histag片段的氨基酸序列如seq id no.4所示。
7、进一步地,所述重组人表皮生长因子和halotag标签蛋白之间插入一个氮端tev酶切位点,所述氮端tev酶切位点的氨基酸序列如seq id no.5所示;
8、所述重组人表皮生长因子和histag片段之间插入一个碳端tev酶切位点,所述碳端tev酶切位点的氨基酸序列如seq id no.6所示;
9、前后两个tev酶切位点确保所纯化出的halo-rhegf蛋白的完整性。
10、上述更进一步地,所述halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示,所述halo-rhegf具有良好的可溶性和完整序列,确保rhegf具有正确的折叠结构和生物学活性。
11、本发明的第三个目的在于提供一种质粒载体,所述质粒载体含有如seq id no.2所示的halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的序列。
12、本发明的第四个目的在于提供一种halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的制备方法,具体步骤如下:
13、s1、人工合成rhegf基因,在rhegf基因的碳端插入histag片段,得到插入histag的rhegf基因序列,所述rhegf基因的序列如seq id no.7所示;
14、s2、将步骤s1中得到的插入histag的rhegf基因序列插入到含有halotag基因序列的表达载体质粒中,构建halo-rhegf表达载体;
15、s3、将步骤s2中得到的halo-rhegf表达载体转化至大肠杆菌中,诱导进行重组蛋白表达,得到含有halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的细菌沉淀;
16、s4、将步骤s3中得到的含有halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的细菌沉淀重悬,再进行细菌裂解后得到含有halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的细菌裂解液;
17、s5、采用镍离子亲和柱和阴离子交换柱对步骤s4中得到的含有halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的细菌裂解液进行纯化洗涤后,得到halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白。
18、进一步地,步骤s4中,halo-rhegf重组蛋白先通过histag标签蛋白与镍离子亲和柱的结合,洗脱使重组蛋白和histag标签的分离;洗脱液经halotag标签蛋白与阴离子交换柱的结合进一步纯化,洗脱得到halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白。
19、本发明的第四个目的在于提供一种halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白的应用,所述halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白在制备具有缓释功能的药物中的应用。
20、进一步地,所述缓释药物中还包括富含阳离子的生物材料;带有阴离子的halotag标签蛋白能够与阳离子的生物材料通过离子键进行结合,由于离子键结合的可逆性使得halo-rhegf能够从生物材料上缓慢释放出来,起到了蛋白药物的缓释作用。
21、上述更进一步地,所述生物材料包括富含阳离子的多聚材料,如q sepharose(富含季胺(q)官能团[-ch2-n+(ch3)3]的带阳离子的微球)。
22、进一步地,所述halotag标签蛋白-重组人表皮生长因子融合蛋白用于制备halo-rhegf缓释微球。
23、与现有技术相比,本发明的有益效果如下所示:
24、1、本发明通过halotag标签蛋白技术制备得到halo-rhegf,halotag标签控制蛋白halo-rhegf的可溶性,histag标签实现蛋白halo-rhegf的分离纯化,同时这一方法制备出的halo-rhegf蛋白也可用于荧光标记和缓释调控。
25、2、本发明通过halotag标签蛋白技术制备的halo-rhegf蛋白表达量高,纯化方法简单,结果稳定,具有较好的重复性。
26、3、halo-rhegf蛋白的纯化方法较为简单,不需要凝胶过滤层析法纯化(耗时耗材,且蛋白易降解);只需镍离子亲和柱和阴离子交换柱两步法就能完成,节约了时间和成本。
27、4、halo-rhegf蛋白可用于rhegf蛋白缓释,延长了药物的作用时间,这对于蛋白药物的高效给药具有重要意义。
28、5、本发明通过在rhegf氮端加入halotag,有助于halotag后续目的蛋白的结构折叠。与现有技术相比,fgf与egf属于不同种类的细胞因子,其分子大小、折叠结构完全不一致,因此不能简单从fgf推断出egf。
29、6、hacat细胞为角质化上皮细胞的细胞株,而nih 3t3细胞为成纤维细胞的细胞株,本发明通过选取这两个细胞检测halo-rhegf对上皮和成纤维两种细胞的增殖的调控作用,显示出halo-rhegf蛋白药物具有良好的作用效果。
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