一种基于DNA三棱柱的单体探针及其制备方法与应用

本申请属于生物传感，涉及一种基于dna三棱柱的单体探针及其制备方法与应用。

背景技术：

1、microrna是一种内源性非编码单链rna分子，其在调节基因表达中扮演着关键角色。它们对于生物体的正常发育、细胞周期调控、细胞分化以及维持组织稳态等方面至关重要。大量研究表明，microrna的异常表达与多种严重危害健康的疾病密切相关，包括癌症、心脑血管疾病和神经退行性疾病等。microrna可作为疾病生物标志物，对其进行检测有助于疾病的早期诊断、进展监测以及预后评估。

2、无酶核酸扩增技术为检测低丰度的microrna提供了有力工具，包括催化发夹组装反应(cha)，熵驱动反应(edr)，以及杂交链反应(hcr)。其中，hcr具有一对多的信号放大特性，且其特定的线性延伸特点可以赋予核酸反应器件更多的可能性。然而，这些动态dna反应通常依赖于自由扩散反应物之间的随机碰撞，限制了它们的运行速度和效率。此外，寡核苷酸链直接进入细胞的过程具有挑战性，在复杂的生化环境中，其稳定性相对较低，容易被酶降解。此外，为提高探针递送入细胞的能力，常见探针的尺寸多为纳米级，但这类探针容易通过细胞胞吐排除胞外，且运动灵活度较大，不利于待测物的原位成像。

3、dna具有可编程性、高度特异性和良好的生物相容性，因此成为制备预定义拓扑结构的动态自组装结构的理想底物。近年来，dna框架核酸作为一种新兴策略，在生物医药领域得到广泛应用。dna四面体、dna三棱柱、dna立方体等结构已被广泛用于生物传感、生物成像和药物递送等领域。这些框架核酸创造了一个有限的空间域，确保在框架上组装的功能核酸之间具有有限的距离，从而大大缩短了反应物发生碰撞所需的时间，有助于提高反应动力学。与此同时，这些核酸载体具有扩展的空间维度和增强的结构稳定性，它们特定的几何形状有助于改善对质膜的渗透。这些特性为构建纳米级前体提供了强大的工具，这些前体可以在特定的目标物作用下组装成微米级网络，有望在肿瘤诊断和治疗中发挥最大的应用价值。因此迫切需要开发一种特异性强、结构可控的dna纳米器件，用于实现对活细胞中低丰度microrna的快速、灵敏、原位成像。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种可以检测活细胞中microrna-21的结构可控的dna纳米器件。在待测microrna-21的触发下可实现纳米级单体到微米级人工聚集体的快速转变，可用于对活细胞内microrna-21的快速、灵敏、原位成像。

2、为解决上述技术问题，本申请提供了以下技术方案：

3、本申请提供一种基于dna三棱柱的单体探针，所述单体探针包括一个dna三棱柱，以及两组用于识别microrna的发夹链h1和h2，h3和h4；其中，所述dna三棱柱的上下底面包含单链区域，所述单链区域与所述h1、h2、h3和h4通过碱基互补配对连接。

4、本申请还提供一种制备所述基于dna三棱柱的单体探针的方法，所述方法包括如下步骤：

5、步骤1：合成dna单链t1、t2、t3、h1、h2、h3和h4；

6、步骤2：将步骤1合成的dna单链t1、t2、t3、h1、h2、h3和h4通过退火自组装形成所述单体探针。

7、本申请还提供一种基于dna三棱柱的单体探针在制备检测活细胞中microrna表达水平的产品中的应用，其中所述产品包括基于dna三棱柱的微米级聚集体核酸反应器，所述基于dna三棱柱的微米级聚集体核酸反应器由多个基于dna三棱柱的单体探针组成。

8、本申请还提供一种基于所述的基于dna三棱柱的单体探针的microrna检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

9、步骤1：将基于dna三棱柱的单体探针溶液与待测物microrna混合孵育后，使用荧光光谱仪记录混合物溶液中cy5荧光信号变化以实现对microrna的检测；

10、步骤2：使用microrna模拟物与microrna抑制剂预处理细胞，用以上调和下调细胞中microrna的表达水平；

11、步骤3：将基于dna三棱柱的单体探针与预处理后的细胞混合孵育后，使用共聚焦显微镜进行细胞成像，通过活细胞cy5荧光信号变化的成像以实现对microrna-21的细胞内检测。

12、有益效果

13、本申请相比于现有技术，所具备的优点在于：

14、(1)本申请提供的dna三棱柱仅由3条dna长链组装而成，具有设计简单、组装迅速、选择性良好以及生物相容性好等优点。

15、(2)本申请提供的dna三棱柱提供了局域的三维空间，与自由扩散的系统相比，大大缩短了反应物之间的距离，相当于对反应物进行了预浓缩，从而大大提高了反应物之间的碰撞概率，使得目标物识别过程在很短的时间内完成，并且探针可以识别pm级别的目标物，这有利于对目标物的快速、灵敏检测。

16、(3)本申请整合了杂交链反应，被广泛应用在低丰度生物分子的检测中，有利于实现对痕量microrna-21的灵敏成像及分析。

17、(4)本申请整合了杂交链反应，且采用了分布在四个方向的发夹链。利用杂交链反应的线性延伸特点，基于dna三棱柱的单体探针可以组装成微米级网络。这种大尺寸的核酸结构体积较大，迁移速度较慢，且不利于被细胞排出，具有更长的胞内停留时间，适用于目标物的原位成像以及信号的长时间保留。

18、(5)本申请构建了可以快速、灵敏、原位成像活细胞中microrna-21的纳米器件，可用于不同细胞中microrna-21表达水平的监测，为疾病的早期诊断提供了一种有价值的工具。

技术特征：

1.一种基于dna三棱柱的单体探针，其特征在于，所述单体探针包括一个dna三棱柱，以及两组用于识别microrna的发夹链h1和h2，h3和h4；其中，所述dna三棱柱的上下底面包含单链区域，所述单链区域与所述h1、h2、h3和h4通过碱基互补配对连接。

2.根据权利要求1所述的基于dna三棱柱的单体探针，其特征在于，所述dna三棱柱由t1、t2、t3三条寡核苷酸链组装而成，所述t1、t2和t3三条寡核苷酸链的序列分别如seq idno：1-3所示。

3.根据权利要求1所述的dna三棱柱单体探针，其特征在于，所述发夹链h1、h2、h3和h4的序列分别如seq id no：4-7所示。

4.根据权利要求1所述的基于dna三棱柱的单体探针，其特征在于，所述h1与h3的5’端的第8个碱基处连接荧光基团，所述h1与h3的5’端的第34个碱基处连接淬灭基团。

5.根据权利要求4所述的基于dna三棱柱的单体探针，其特征在于，所述荧光基团选用cy5，所述淬灭基团选用bhq2。

6.根据权利要求1所述的基于dna三棱柱的单体探针，其特征在于，所述microrna为microrna-21，所述microrna-21模拟物的序列如seq id no：8所示。

7.一种制备权利要求1所述基于dna三棱柱的单体探针的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，退火自组装为，将步骤1合成的dna单链t1、t2、t3、h1、h2、h3和h4在tae缓冲溶液中等摩尔混合，将溶液升高至95℃，维持5分钟，随后缓慢降低至25℃，并在25℃维持30分钟，得所述的基于dna三棱柱的单体探针。

9.基于权利要求1所述的基于dna三棱柱的单体探针在制备检测活细胞中microrna表达水平的产品中的应用，其中所述产品包括基于dna三棱柱的微米级聚集体核酸反应器，所述基于dna三棱柱的微米级聚集体核酸反应器由多个基于dna三棱柱的单体探针组成。

10.基于权利要求1所述的基于dna三棱柱的单体探针的microrna检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

技术总结本申请公开了一种基于DNA三棱柱的单体探针，所述单体探针包含DNA三棱柱结构以及用于检测microRNA‑21的四条发夹链H1，H2，H3和H4。其中，所述DNA三棱柱由三条DNA长链组装而成，并通过碱基互补配对原则与H1，H2，H3和H4发夹链连接。在发夹H1与H3中引入荧光标记与淬灭基团，当microRNA‑21存在时，单体探针通过杂交链反应快速形成微米级聚集体结构，伴随着荧光信号的变化，从而实现对活细胞中microRNA‑21的原位成像。通过实验验证发现，本申请公开的纳米器件灵敏度高，组装迅速，生物相容性佳，为疾病标志物诊断提供了一种重要工具。技术研发人员：徐静娟,李晓琼受保护的技术使用者：南京大学技术研发日：技术公布日：2024/11/4