用于治疗HSV的手段和方法与流程

本发明涉及一种疫苗组合物，其包含用于治疗hsv或针对hsv疫苗接种的单纯疱疹病毒(hsv)多肽的多聚复合物。本发明还涉及包含编码hsv多肽的多核苷酸的载体和包含该载体的宿主细胞。本发明进一步包含一种用于产生所述疫苗组合物的方法。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒是称为疱疹病毒的病毒科的一个病毒属。感染人类的种通常称为单纯疱疹病毒1(hsv-1)和单纯疱疹病毒2(hsv-2)，其正式名称分别为人疱疹病毒1(hhv-1)和人疱疹病毒2(hhv-2)。hsv-1的初始感染通常发生在儿童期或青春期，并且持续终生。hsv-1的感染率在全球范围内为40％至80％，在社会经济地位较低的人群中较高。在许多情况下，暴露于hsv-1的人表现出无症状的血清转变。但是，最初的感染也可能是严重的，其导致广泛的1至2毫米水疱，并伴有干扰进食和饮水直至脱水的严重不适，其在接种后1至26天发生，持续10至14天。复发性唇疱疹影响大约三分之一的美国人群，这些患者通常每年经历1至6次发作。红斑基底上的丘疹在数小时内变成囊泡，并随后在72至96小时内经历溃疡、结痂和愈合阶段(cernik等，2008,arch intern med.,vol.168,pp.1137-1144)。据2003年的全球估计假设16.2％的人感染了hsv-2，这是生殖器疱疹的主要原因。病毒通过进入称为潜伏期的非复制状态从而成功躲避免疫系统清除的能力导致了终身感染。潜伏期的周期性再活化是可能的，并导致病毒从初始感染的部位脱落。由于疱疹导致的生殖器损伤通常非常疼痛，并且可导致实质性的心理疾病。此类病毒也可以在出生时由母亲传染给孩子。如果不进行治疗，80％患有播散性疾病的婴儿会死亡，而那些幸存下来的患者往往会脑损伤。此外，生殖器疱疹使hiv感染的风险增加2到3倍，使每次性行为传播hiv的风险增加5倍，并且在高hsv-2发病人群中，可占到新感染hiv的40％到60％(looker等，2008,bulletin of theworld health organization,vol.86,pp.805-812)。

2、目前，合成的无环嘌呤-核苷类似物阿昔洛韦(acyclovir)是hsv感染的标准疗法，并且极大地帮助控制症状。前体药物，伐昔洛韦(valacyclovir)(转化为阿昔洛韦)和泛昔洛韦(famciclovir)(转化为喷昔洛韦(penciclovir))已获得许可，并且分别具有比阿昔洛韦和喷昔洛韦更好的口服生物利用度。由于现有的药物仅在病毒感染的细胞内被病毒胸苷激酶转化为活性药物，因此，它们具有极好的安全性。然而，通过产生胸苷激酶缺陷型突变体或通过选择具有不能使阿昔洛韦磷酸化的胸苷激酶的突变体，hsv可通过编码胸苷激酶的病毒基因中的突变对阿昔洛韦产生抗性。尽管在一些中检测到了改变的dna聚合酶，但是大多数对阿昔洛韦耐药的临床hsv分离株均缺乏胸苷激酶。由于hsv在活化之前可以在神经元中潜伏数月或数年，因此此类疗法可用于治疗由hsv引起的症状，但不能避免病毒的周期性再活化。

3、因此，对抗hsv的最有效和最经济的方法是防止病毒的初始感染和/或周期性再活化的疫苗。在过去几十年中，已经在开发此类疫苗方面付出了很多努力。然而，开发有效的hsv疫苗的尝试聚焦在有限数量的在临床试验中表现不佳的抗原上。因此，迫切需要一种针对hsv的疫苗。

技术实现思路

1、疫苗组合物

2、本发明满足这种需要并提供新的疫苗组合物，其包含单纯疱疹病毒(hsv)多肽ul11、ul16和ul21的多聚复合物、单纯疱疹病毒(hsv)多肽ul48、ul49和ge的多聚复合物或单纯疱疹病毒(hsv)多肽ul31和ul34的多聚复合物。

3、术语“多聚复合物”或“复合物”在本文中可互换使用，是指由至少两个多肽亚基以及任何共价连接的分子(比如脂质锚或寡糖)或非蛋白质辅基(比如核苷酸或金属离子)组成的稳定的多肽复合物。在本上下文中，辅基是指一种紧密结合的辅助因子。因此，多聚复合物可包含两个多肽(即二聚体)、三个多肽(即三聚体)或四个多肽(即四聚体)。本发明的多聚复合物涉及一组相互作用的蛋白质，已显示此类蛋白质在体内作为功能单元存在，并且本发明的多聚复合物的多肽可使用严格的蛋白质纯化方法共纯化。这种严格的蛋白质纯化方法使用的缓冲液和溶液不会强制非特异性和/或人工蛋白质相互作用，因此只能纯化在经受严格洗涤条件时保持完整的复合物(即，复合物的多肽未释放)。因此，仅显示多肽相互作用的方法，例如免疫沉淀或从细胞提取物的下拉(pull-down)实验不被看作是适合纯化本发明复合物的方法。同样地，仅显示多肽共定位或多肽相互作用的方法并不指示本发明的复合物，特别是如果这种方法采用人工修饰的多肽，比如如酵母双杂交系统。因此，在纯化后，可以使用合适的方法(例如尺寸排阻色谱法)检测本发明的复合物。因此，在组合物中仅存在两种或更多种多肽(其可能已经显示为在体内作为复合物存在)不被认为是本发明的复合物，因为这样的复合物可以仅使用特定的纯化方法和条件形成，并且只有纯化后在特定的储存条件下才能稳定。因此，即使某些多肽在体内已经显示形成了复合物，所述多肽也可能以单体存在于溶液中。在一个实施方案中，所述多聚复合物为包含hsv多肽ul11和ul16的二聚体。在进一步的实施方案中，所述复合物为包含hsv多肽ul16和ul21的二聚体。在优选的实施方案中，所述复合物为包含hsv多肽ul11、ul16和ul21的三聚体。在进一步优选的实施方案中，所述多聚复合物是三聚体，并且包含hsv多肽ul11、ul16和ul21或由hsv多肽ul11、ul16和ul21组成。在一个实施方案中，所述多聚复合物是包含hsv多肽ul48和ul49的二聚体。在进一步的实施方案中，所述复合物是包含hsv多肽ul49和ge的二聚体。在优选的实施方案中，所述复合物是包含hsv多肽ul48、ul49和ge的三聚体。在进一步优选的实施方案中，所述多聚复合物是三聚体，并且包含hsv多肽ul48、ul49和ge或由hsv多肽ul48、ul49和ge组成。在进一步优选的实施方案中，所述复合物是包含hsv多肽ul31和ul34或由hsv多肽ul31和ul34组成的二聚体。在本发明的多聚复合物中，所述蛋白质中的一种或多种可包含另外的b和/或t细胞表位。所述t细胞表位可以是cd4 t细胞表位或cd8 t细胞表位。优选地，本发明的复合物提供协同效应。因此，与单一蛋白质相比，本发明的复合物优选能够在患者pbmc的elispot分析中引发更强的免疫应答。

4、可以使用本领域已知的合适的手段和方法产生本发明的复合物。通过在宿主细胞中共表达复合物的单个多肽，使得复合物在宿主细胞中形成，从而可以产生本发明的复合物。本发明的复合物还可以通过如下产生：在分开的宿主细胞中表达所述复合物的单个多肽，从所述宿主细胞中纯化单个多肽，并在允许形成复合物的条件下在体外混合所述单个多肽。然而，本发明的复合物还可以通过如下产生：在分开的宿主细胞中表达所述复合物的单个多肽，从所述宿主细胞中纯化单个多肽，并将所述单个多肽施用于受试者使得所述复合物在体内形成。可以在模拟体内条件(即37℃、血液、血清和生理盐浓度)的模型系统中确定在将复合物的单个多肽施用于受试者后复合物是否在体内形成。

5、所述疫苗组合物的多肽可包含标签。如本文所用的多肽标签是与重组多肽基因融合的氨基酸序列，其使所述多肽能够被纯化和/或检测。所述疫苗组合物的多肽可以与ha-标签、flag-标签、myc-标签、v5-标签、strep-标签、strepii-标签、sof-标签、his-strep-标签、avi-标签、钙调蛋白-标签、e-标签、s-标签、sbp-标签、tc-标签、vsv-标签、xpress-标签、ty-标签、halo-标签、nus-标签、硫氧还蛋白-标签、fc-标签、甲壳素结合蛋白(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、绿色荧光蛋白(gfp)融合。在一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物的多肽与多组氨酸-标签融合，所述多组氨酸-标签可以由6或12个his-残基组成，其中优选8个his-残基组成。优选通过多肽连接子使多肽标签与所述疫苗组合物的多肽融合。多肽连接子和8his-标签的优选组合示于seq id no:10。

6、“多肽”指包含通过肽键连接到一起的氨基酸的聚合物的分子。所述术语在本文中并不是指所述分子的特定长度，因此在本文中可与术语“蛋白质”互换使用。当在本文中使用时，术语“多肽”或“蛋白质”还包括由表达盒或载体表达或者可以从本发明的宿主细胞中分离的“目的多肽”或“目的蛋白质”。多肽包含氨基酸序列，并因此，有时包含氨基酸序列的多肽在本文中称为“包含多肽序列的多肽”。因此，本文中术语“多肽序列”与术语“氨基酸序列”可互换使用。

7、术语“氨基酸”或“aa”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的氨基酸类似物(analog)和氨基酸模拟物(mimetic)。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及之后修饰的那些氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构的化合物，即，将碳连接至氢、羧基、氨基和r基，如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸的甲基锍。这些类似物具有修饰的r基(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但是以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的化学化合物。

8、“表位”是指由免疫系统(例如b细胞或t细胞)识别的抗原的一部分。该术语涵盖构象和线性(或连续)表位。构象表位包含抗原的氨基酸序列的不连续部分，而线性表位由抗原的氨基酸序列的连续部分组成。构象表位还可包含两个或更多个抗原的氨基酸序列的部分。该术语进一步包括隐性表位(cryptotope)和新表位(neotope)。“隐性表位”为隐藏在天然存在的抗原(例如病毒)中、但当抗原不以其天然构象存在时可变为可及的表位。“新表位”为仅在蛋白质的四级结构中发现但在蛋白质单体中未发现的表位。

9、b细胞表位是由特定膜结合的b-细胞受体(bcr)或抗体识别的抗原(如，天然蛋白质)的区域。许多方法可容易地获得以识别或选择b-细胞表位，包括x射线晶体学、基于阵列的寡肽扫描、定点诱变、诱变作图(mapping)和噬菌体展示，以及如由sun等，comput mathmethods med.2013；2013:943636所综述的计算方法。举例而言，合适的方法包括基于结构的预测模型，其依赖于抗原的3d结构及表位相关的倾向量表(propensity scale)，包括几何属性及特异性物理化学性质。基于结构的算法以及web服务器(程序)包括，例如epsvr&epmeta(http://sysbio.unl.edu/services/)、epces(http://sysbio.unl.edu/services/epces/)和epitopia(http://epitopia.tau.ac.il/)。基于模拟表位的预测方法是需要抗体亲和性选择的肽以及抗原的3d结构二者作为输入的组合方法。基于模拟表位的预测模型的示例性算法及程序包括如mimopro(http://informatics.nenu.edu.cn/mimopro)、pepsurf(http://pepitope.tau.ac.il)和episearch(http://curie.utmb.edu/episearch.html)。此外，基于序列的预测模型是可用的，其仅依赖于抗原的一级序列，例如，如在sun等comput math methods med.2013；2013:943636中综述的best及zhang的方法。另外，可使用结合位点预测模型，其推断出聚焦于蛋白质-蛋白质相互作用、抗原和抗体的相互作用的结合位点预测的方法，例如promate、consurf、pinup及pier。

10、t细胞表位通常源自经加工的蛋白质抗原。t细胞表位可以是cd4-t细胞表位或cd8t-细胞表位。尽管细胞毒性(cd8)t细胞识别由mhc i类分子所展示的细胞内肽(cd8t-细胞表位)，t辅助细胞识别自细胞外空间获得且由mhc ii类分子展示的肽(cd4t-细胞表位)。肽:mhc复合物(pmhc)与t-细胞受体相互作用，从而导致所述复合物的活化并随后诱导细胞免疫应答。许多t细胞表位预测和/或选择的电脑模拟(in silico)方法是可用的。对于cd8+t细胞表位预测，可使用如larsen等bmc bioinformatics 2007,8:424中所综述的netctl-1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/netctl/)、epijen(http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/epijen/epijen.htm)或mappp(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/mappp/)。对于cd4+t细胞，表位预测的计算模型已由oyarzún p等bmc bioinformatics2013,14:52综述并包括依赖于肽序列比较以识别结合基序的数据驱动方法，如rankpep(http://imed.med.ucm.es/tools/rankpep.html)、tepitope和nn-align(http://www.cbs.dtu.dk/services/nnalign/)以及实施分子建模计算以评估结合能量，由此使得独立于实验结合数据的基于结构的方法，如netmhciipan-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/netmhciipan-2.0/) 、 tepitopepan(http://www.biokdd.fudan.edu.cn/service/tepitopepan/) 和 predivac(http://predivac.biosci.uq.edu.au/)。

11、术语“单纯疱疹病毒”和“hsv”在本文中可互换使用，并且通常指疱疹病毒单纯疱疹病毒属的病毒，即侏猴(ateline)疱疹病毒1、牛疱疹病毒2、猕猴(cercopithecine)疱疹病毒1、猕猴(cercopithecine)疱疹病毒2、猕猴(cercopithecine)疱疹病毒16、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、小袋鼠(macropodid)疱疹病毒1、小袋鼠(macropodid)疱疹病毒2、猿猴(saimiriine)疱疹病毒1。单纯疱疹病毒属的优选病毒种为感染人的病毒。甚至更优选的病毒种为单纯疱疹病毒1(hsv-1)和单纯疱疹病毒2(hsv-2)，其分别称为人疱疹病毒1和2(hhv-1和hhv-2)。

12、如本文所用的术语“疫苗组合物”涉及包含本发明的多聚复合物的组合物，其可用于预防或治疗受试者中与hsv相关的病理状态。“疫苗组合物”可以包含或不包含一种或多种增强活性组分的免疫活性的其它组分，例如缓冲剂、还原剂、稳定剂、螯合剂、填充(bulking)剂、渗透平衡剂(张力剂)；表面活性剂、多元醇、抗氧化剂；冻干保护剂；消泡剂；防腐剂；和着色剂、去污剂、钠盐和/或抗菌剂等。所述疫苗组合物可另外包含药物组合物中常用的其它组分。本发明的疫苗优选用于人和/或兽医用途。所述疫苗组合物可以是无菌和/或无热原的。所述疫苗组合物对人可以是等渗的。

13、优选地，所述疫苗组合物包含治疗有效量的本发明的或通过本发明的方法可获得的多聚复合物。

14、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ul11包含与seq id no:1的氨基酸序列具有75％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ul11能够引发免疫应答。

15、当在本文中使用时，术语“ul11”涉及hsv的被膜蛋白。seq id no:1示例性地描绘了hsv-2ul11的氨基酸序列，其也以登录号ahg54674.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ul11”还涵盖具有与seq id no:1所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ul11多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq id no:1所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ul11”涵盖这样的多肽，其与seq id no:1的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、74％、73％、72％、71％、70％或优选75％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:1的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、26、27、28、29或优选24个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ul11蛋白可以与ul16、ul21和/或ge或ge的胞质尾区形成复合物。因此，优选的ul11蛋白可以与ul16或ge或ge的胞质尾区形成二聚体，可以与ul16和ul21或与ul16和ge或ge的胞质尾区形成三聚体和/或可以与ul16、ul21和ge或ge的胞质尾区形成四聚体。

16、“序列同一性”或“％同一性”是指使用标准化算法比对的至少两个多肽序列之间的残基匹配的百分数。为了使得两条序列之间的比对最佳，这种算法可以以标准化的和可重现的方式在比较的序列中插入间隙(gap)，因此达到两条序列的更加有意义的比较。对于本发明的目的，采用ncbi blast程序2.3.0版本(2016年1月13日)(altschul等，nucleicacids res.(1997)25:3389-3402)测定两条氨基酸序列之间的序列同一性。可以采用设定如下参数的blastp测定两条氨基酸序列的序列同一性：矩阵：blosum62，字长：3；期望值：10；空位罚分：存在＝11，延伸＝1；组合调整(compositional adjustment):有条件的组合评分矩阵调整。

17、术语“免疫应答”是指(优选但不限于在体内)诱导体液和/或细胞介导的免疫应答的能力。体液免疫应答包括b细胞介导的抗体应答。细胞介导的免疫包括t细胞介导的免疫应答，包括但不限于cd4+t细胞和cd8+t细胞。抗原引发免疫应答的能力称为免疫原性，其可以是体液和/或细胞介导的免疫应答。优选地，本发明的免疫应答是针对hsv的免疫应答，和甚至更优选地是针对受试者中hsv感染的免疫应答。

18、在体内诱导体液和/或细胞介导的免疫应答的能力可以使用生殖器hsv-2感染的豚鼠模型来确定，该模型准确地反映了人类的疾病，并且代表了检验发病机理及候选抗病毒化合物和疫苗的治疗功效的系统。该模型还可作为解决生殖器-驻留和神经组织-驻留免疫记忆性质的理想系统。豚鼠的生殖器感染导致自限性外阴阴道炎，其神经系统表现反映在人类疾病中发现的那些。雌性豚鼠的原发性疾病涉及生殖器上皮细胞中的病毒复制，其通常限于8天。在此期间，病毒到达感觉神经末梢并通过逆行转运将病毒转运至感觉神经节中的细胞体和脊髓中的自主神经元。在该部位进行短暂的急性复制后，免疫系统通常在接种后第15天解决急性病毒复制，并将病毒维持为感觉神经元的终生潜伏感染。从原发性hsv-2生殖器感染恢复后，豚鼠经历偶发性、自发性、复发性感染和疾病。hsv-2复发可表现为临床上明显的疾病，此疾病伴有会阴部红斑和/或水疱性病变，或者表现为以病毒从生殖道脱落为特征的无症状复发。例如，可以使用豚鼠生殖器感染模型评估疫苗效力。可以采用5×101pfu、5×102pfu、5×103pfu、5×104pfu、5×106pfu、5×107pfu、5×108pfu或5×109pfu和优选地5×105pfu的hsv-2(如菌株ms)阴道内感染动物。在感染之前或之后免疫动物一次、两次、三次、四次、五次或更多次。优选地，在感染后第15天，以15天的间隔免疫动物两次。通常，任何合适的施用途径均可用于免疫。然而，优选地，肌内地免疫动物。采用仅佐剂(如，cpg 100μg/alum 150μg)或pbs(两组均为阴性对照)，或采用hsv-2d15-29突变病毒株(阳性对照)模拟免疫可能的对照组。在每轮免疫中，采用疫苗候选物与佐剂联合免疫的组可接受0.1μg、0.5μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、10μg、15μg、25μg、30μg、35μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg和优选地20μg的相应抗原的剂量。作为读出，可以例如，从感染后第0天至第200天、感染后第1天至第180天、感染后第3天至第160天、感染后第5天至第140天、感染后第7天至第120天、感染后第10天至第100天、感染后第12天至第90天收集阴道拭子来评估复发性病毒脱落的频率和程度。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天收集阴道拭子。优选地，从感染后第15天至第85天，每天收集阴道拭子。在相同的时间间隔内，每天对复发性生殖器疱疹病变的严重程度(分数0至4)和持续时间进行评分。优选地，在研究结束时，测定抗体应答以及cd4+和cd8+t细胞应答。

19、可以采用多种途径施用本发明的疫苗组合物，包括但不限于口服、局部、透皮、皮下、静脉内、腹膜内、肌内或眼内。然而，如果需要，本领域技术人员可以容易地选择任何其它途径。

20、施用于受试者的本发明疫苗组合物的确切剂量可取决于治疗目的(例如急性疾病治疗与预防性疫苗接种)、施用途径、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症的严重程度，并且可由本领域技术人员通过常规实验确定。优选地，所述施用剂量为有效剂量，即有效引发免疫应答的剂量。

21、本发明的疫苗组合物可以向受试者施用一次或多次，比如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。

22、如本文所用的“受试者”是指动物，优选哺乳动物，其可以是例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、狗、猫或灵长类动物。优选地，所述受试者是人。然而，术语“受试者”还包括细胞，优选哺乳动物细胞，甚至更优选的为人细胞。这种细胞可以是免疫细胞，优选淋巴细胞。

23、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ul16包含与seq id no:2的氨基酸序列具有75％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ul16能够引发免疫应答。

24、当在本文中使用时，术语“ul16”涉及hsv的被膜蛋白。seq id no:2示例性地描绘了hsv-2ul16的氨基酸序列，其也以登录号ahg54679.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ul16”还涵盖具有与seq id no:2所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ul16多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq id no:2所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ul16”涵盖这样的多肽，其与seq id no:2的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、71％、70％、69％、68％、67％或优选72％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:2的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或优选地104个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ul16蛋白可以与ul11、ul21和/或ge或ge的胞质尾区形成复合物。因此，优选的ul16蛋白可以与ul21或ul11形成二聚体，可以与ul11和ul21形成三聚体和/或可以与ul11、ul21和ge或ge的胞质尾区形成四聚体。

25、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ul21包含与seq id no:3的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ul21能够引发免疫应答。

26、当在本文中使用时，术语“ul21”涉及hsv的被膜蛋白。seq id no:3示例性地描绘了hsv-2ul21的氨基酸序列，其也以登录号ahg54684.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ul21”还涵盖具有与seq id no:3所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ul21多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq id no:3所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ul21”涵盖这样的多肽，其与seq id no:3的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、79％、78％、77％、76％、75％或优选80％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:3的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或优选地134个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ul21蛋白可以与ul11、ul16和/或ge或ge的胞质尾区形成复合物。因此，优选的ul21蛋白可以与ul16形成二聚体，可以与ul11和ul16形成三聚体和/或可以与ul11、ul16和ge或ge的胞质尾区形成四聚体。

27、如本文所述，包含在本发明的疫苗组合物中的多聚复合物还可以是包含四个多肽(即四聚体)的多肽复合物。因此，包含hsv多肽ul11、ul16、ul21的本发明的多聚复合物可以进一步包含hsv多肽ge。在这种情况下，本发明的多聚复合物包含hsv多肽ul11、ul16、ul21和ge。

28、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ge包含与seq id no:4的氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ge能够引发免疫应答。

29、当在本文中使用时，术语“ge”有时可被称为“糖蛋白e”。seq id no:4示例性地描绘了hsv-2ge的氨基酸序列，其也以登录号ahg54732.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ge”还涵盖具有与seq id no:4所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ge多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq id no:4所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ge”涵盖这样的多肽，其与seq id no:4的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、69％、68％、67％、66％、65％或优选70％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:4的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180或优选地165个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ge蛋白可以与ul11、ul16和ul21形成复合物。因此，优选的ge蛋白可以与ul11形成二聚体，可以与ul11和ul16形成三聚体和可以与ul11、ul16和ul21形成四聚体。

30、在本发明进一步优选的实施方案中，包含在本发明的疫苗组合物中的包含hsv多肽ul11、ul16、ul21的多聚复合物也可以是包含hsv多肽ge的胞质结构域的四聚体。在这种情况下，本发明的多聚复合物包含hsv多肽ul11、ul16、ul21和ge的胞质结构域。

31、优选地，本发明的疫苗组合物的ge的胞质结构域包含seq id no:5所示的氨基酸序列。然而，本文还设想ge的胞质结构域包含这样的氨基酸序列，其与seq id no:5的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、79％、78％、77％、76％、75％或优选80％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:5的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27或优选地23个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ge的胞质结构域可以与ul11、ul16和ul21形成复合物。因此，优选的ge的胞质结构域可以与ul11形成二聚体，可以与ul11和ul16形成三聚体和可以与ul11、ul16和ul21形成四聚体。

32、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ul48包含与seq id no:6的氨基酸序列具有80％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ul48能够引发免疫应答。

33、当在本文中使用时，术语“ul48”涉及hsv的被膜蛋白vp16。seq id no:6示例性地描绘了hsv-2ul48的氨基酸序列，其也以登录号ahg54712.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ul48”还涵盖具有与seq id no:6所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ul48多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq id no:6所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ul48”涵盖这样的多肽，其与seq id no:6的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、79％、78％、77％、76％、75％或优选80％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:6的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或优选地98个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ul48蛋白可以与ul49形成二聚体，或可以与ul49和ge或ge的胞质尾区形成三聚体。

34、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ul49包含与seq id no:7的氨基酸序列具有62％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ul49能够引发免疫应答。

35、当在本文中使用时，术语“ul49”涉及hsv的被膜蛋白vp22。seq id no:7示例性地描绘了hsv-2ul49的氨基酸序列，其也以登录号akc42813.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ul49”还涵盖具有与seq id no:7所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ul49多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq id no:7所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ul49”涵盖这样的多肽，其与seq id no:2的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、74％、73％、72％、71％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、61％、60％、59％、58％、57％或优选62％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:7的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130或优选地115个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ul49蛋白可以与ul48和/或ge或ge的胞质尾区形成复合物。因此，优选的ul49蛋白可以与ul48或ge或ge的胞质尾区形成二聚体，或可以与ul48和ge或ge的胞质尾区形成三聚体。

36、在本发明进一步优选的实施方案中，包含在本发明的疫苗组合物中的包含hsv多肽ul48、ul49的多聚复合物还可以是包含hsv多肽ge的胞质结构域的三聚体。在这种情况下，本发明的多聚复合物包含hsv多肽ul48、ul49和ge的胞质结构域。

37、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ul31包含与seq id no:8的氨基酸序列具有85％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ul31能够引发免疫应答。

38、当在本文中使用时，术语“ul31”涉及hsv的病毒粒出口蛋白(virion egressprotein)。seq id no:8示例性地描绘了hsv-2ul31的氨基酸序列，其也以登录号ahg54695.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ul31”还涵盖具有与seq id no:8所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ul31多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq idno:8所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ul31”涵盖这样的多肽，其与seq idno:1的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、84％、83％、82％、81％、80％或优选85％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq id no:8的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61或优选地46个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ul31蛋白可以与ul34形成二聚体。

39、优选地，本发明的疫苗组合物的hsv多肽ul34包含与seq id no:9的氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列，其中当以疫苗组合物的形式施用于受试者时，所述hsv多肽ul34能够引发免疫应答。

40、当在本文中使用时，术语“ul34”涉及hsv的病毒粒出口蛋白。seq id no:9示例性地描绘了hsv-2ul34的氨基酸序列，其也以登录号ahg54698.1保藏于ncbi genbank。然而，术语“ul34”还涵盖具有与seq id no:9所示的氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列的ul34多肽，且还涵盖相对于本文所述的seq id no:9所示的参考序列具有突变的多肽。因此，所述术语“ul34”涵盖这样的多肽，其与seq id no:9的氨基酸序列相比，具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％74％、73％、72％、71％、69％、68％、67％、66％、65％或优选70％或更高的氨基酸序列同一性，或涵盖这样的多肽，其与seq idno:9的氨基酸序列相比，具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或优选地75个氨基酸置换、插入和/或缺失。优选的ul34蛋白可以与ul31形成二聚体。

41、如上所述，相对于示于seq id no:1(ul11)、seq id no:2(ul16)、seq id no:3(ul21)、seq id no:4(ge)、seq id no:5(ge的胞质结构域)、seq id no:6(ul48)、seq idno:7(ul49)、seq id no:8(ul31)和seq id no:9(ul34)的参考序列，本发明的每种蛋白质均可含有突变(比如插入、缺失和置换)，只要这些突变不损害本发明疫苗组合物中作为抗原的蛋白的应用。此外，此类突变不应限制所述蛋白质形成本发明的多聚复合物的能力。通过进行蛋白质纯化，并通过如非还原page、蛋白质印迹和/或尺寸排阻色谱来分析所述蛋白，可以测试本发明的多聚复合物的形成。特别地，每种蛋白质可以包含标签，所述标签可以，例如可促进检测、纯化和/或增强溶解度。

42、在本发明进一步优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物的多聚复合物的多肽为hsv-1多肽。

43、在本发明进一步优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物的多聚复合物的多肽为hsv-2多肽。

44、本发明的疫苗组合物可进一步包含药学上可接受的载体或佐剂。

45、术语“载体”和“赋形剂”在本文中可互换使用。药学上可接受的载体包括但不限于稀释剂(填充剂、增容剂，如乳糖、微晶纤维素)、崩解剂(如羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠)、粘结剂(如，pvp、hpmc)、润滑剂(如硬脂酸镁)、助流剂(如胶体sio2)、溶剂/共溶剂(如水性载体、丙二醇、甘油)、缓冲剂(如柠檬酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐)、防腐剂(如苯甲酸钠、对羟苯甲酸酯(me、pr和bu)、bkc)、抗氧化剂(如bht、bha、抗坏血酸)、润湿剂(如聚山梨醇酯、失水山梨糖醇酯)、消泡剂(如二甲基硅油)、增稠剂(如甲基纤维素或羟乙基纤维素)、甜味剂(如山梨糖醇、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜)、调味剂(如薄荷、柠檬油、奶油糖等)、保湿剂(如丙烯、乙二醇、甘油、山梨糖醇)。其它药学上可接受的载体为(生物可降解的)脂质体；由生物可降解的聚合物聚(d,l)-乳酸-共-乙醇酸(poly(d,l)-lactic-coglycolic acid)(plga)制成的微球、白蛋白微球；合成的聚合物(可溶的)；纳米纤维、蛋白质-dna复合物；蛋白质缀合物；红细胞或病毒颗粒。各种基于载体的剂型包括固体脂质纳米颗粒(solidlipid nanoparticle,sln)、聚合物纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、水凝胶纳米颗粒、共聚肽纳米颗粒、纳米晶体和纳米混悬剂、纳米晶体、纳米管和纳米线、功能化纳米载体、纳米球、纳米胶囊、脂质体、脂肪乳剂、脂质微管/微柱(microcylinder)、脂质微泡、脂质球、脂质复合物(lipopolyplex)、逆脂质胶束(inverse lipid micelle)、树枝状聚合物(dendrimer)、醇质体、多组合物(multicomposite)超薄胶囊、水质体(aquasome)、药质体(pharmacosome)、胶质体(colloidosome)、囊泡(niosome)、盘状体(discome)、前囊泡(proniosome)、微球、微乳液和聚合物胶束。其它合适的药学上可接受的赋形剂在remington's pharmaceuticalsciences,15th ed.,mack publishing co.,new jersey(1991)和bauer等人，pharmazeutische technologie,5th ed.,govi-verlag frankfurt(1997)中特别描述。根据如药物组合物的制剂和给药途径，本领域技术人员将能够容易地选择合适的药学上可接受的载体。

46、如本文所用的术语“佐剂”是指增强、增加或强化宿主对抗原或其片段的(抗体和/或细胞介导的)免疫应答的物质。根据本发明应用的示例性佐剂包括无机化合物(比如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙)、tlr9激动剂cpg寡脱氧核苷酸、tlr4激动剂单磷酰脂质(mpl)、tlr4激动剂吡喃葡萄糖脂质(gla)、油包水乳剂montanide isa 51和720、矿物油(比如石蜡油)、病毒颗粒、细菌产物(比如经杀灭的细菌百日咳杆菌(bordetella pertussis)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis))、类毒素、非细菌有机物(比如角鲨烯、乙汞硫柳酸钠(thimerosal))、清洁剂(quil a)、细胞因子(比如il-1、il-2、il-10和il-12)及复合物组合物(比如弗氏(freund's)完全佐剂及弗氏不完全佐剂)。一般而言，根据本发明所用的佐剂优选强化对本发明的多聚复合物的免疫应答和/或调节其朝向所期望的免疫应答。

47、术语“药学上可接受的”是指不干扰根据本发明的多聚复合物的生物活性的有效性的非毒性材料。

48、纯化

49、“纯化”在其所有语法形式中意指移除不期望的化合物，如细胞、细胞碎片、培养基、杆状病毒，完整或不完整的杆状病毒等。取决于表达系统、产量等，合适的纯化方法在现有技术中是容易获得的。例如，纯化可包括离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱和/或混合模式色谱，所有这些先前均已广泛地阐述。如所述，纯化步骤尤其包括移除杆状病毒。所述杆状病毒可包含在可从由杆状病毒载体或bacmam载体感染的宿主细胞获得的培养基和/或上清液中。优选在纯化本发明的多聚复合物时移除此类杆状病毒。

50、如本文所用的纯化还包括可从培养基移除共表达hsv蛋白质的宿主细胞。优选地，该培养基包含本发明的多聚复合物，因为所述宿主细胞可分泌所述多聚复合物。从培养基移除宿主细胞可经由机械力(比如经由离心或过滤)来实施。优选地，通过使用过滤介质(比如，微过滤过滤器或深度过滤器)来实施过滤。微过滤过滤器可由聚醚砜或再生纤维素构成。深度过滤器可由聚丙烯或玻璃纤维构成。

51、然而，还设想所述宿主细胞并非必须分泌所述多聚复合物。若如此，则可收获所述宿主细胞。收获之后，可例如以酶促方式或机械方式破碎所述宿主细胞以便释放多聚复合物，然后可如本文所述纯化多聚复合物。

52、纯化之后，设想将螯合剂添加至所述多聚复合物。

53、储存

54、“储存”在其所有语法形式中意指优选在维持本发明的多聚复合物呈其完整或功能形式(即所述多聚复合物优选类似其天然存在形式)的条件下存储(用于未来使用)。因此设想储存条件不会促进(或甚至阻止)本发明的多聚复合物的崩解。术语“崩解”在本文以其最广泛意义理解且可意指“分解(disassembly)”和/或“变性”。设想本发明的多聚复合物的储存是在包含螯合剂和/或稳定剂的缓冲溶液中。

55、一般而言，任何螯合剂和/或稳定剂均是适宜的，只要其能够储存本发明的多聚复合物且不会促进其崩解即可。

56、根据本发明的缓冲溶液可包含tris缓冲液、nacl、kcl、pbs、hepes缓冲液。

57、所述疫苗组合物的用途

58、本发明还涉及所述疫苗组合物在于受试者中诱导针对hsv的免疫应答的方法中的用途。

59、在本发明的优选实施方案中，所述疫苗组合物用于治疗、预防或改善hsv感染或预防hsv再活化。

60、因此，所述疫苗组合物可用于对抗由hsv和/或相关症状引起的疾病。还设想本发明的疫苗组合物可用于清除受试者中的病毒，即在治疗后，采用本领域普通技术人员已知的合适方法(如pcr、elisa等)在从受试者获得的合适样品中不能检测到hsv。因此，本发明的疫苗组合物可用于阻断原发性感染、阻止原发性疾病、阻断病毒再活化和再感染，以及阻断潜伏(latency)。

61、为了减少生殖器疱疹的机会，需要预防母亲的第一次hsv感染的预防性疫苗，而在母亲被诊断患有活动性hsv感染的情况下则需要有效的疗法。本发明的多聚复合物可，如对于孕妇或儿童用作预防性疫苗，或在血清阳性妇女中用作治疗性疫苗以防止在分娩时的亚临床再活化。

62、在本发明进一步优选的实施方案中，所述疫苗组合物用于在受试者中诱导针对hsv-1或hsv-2的免疫应答的方法中。

63、载体

64、本发明进一步涉及包含编码ul11、ul16和ul21以及任选的ge或ge的胞质结构域的多核苷酸的载体。在本发明进一步的实施方案中，所述载体还可以包含编码ul11和ul16的多核苷酸。在本发明进一步的实施方案中，所述载体还可以包含编码ul16和ul21的多核苷酸。本发明进一步涉及包含编码ul48、ul49和ge或ge的胞质结构域的多核苷酸的载体。在本发明进一步的实施方案中，所述载体还包含编码ul48和ul49的多核苷酸。在本发明进一步的实施方案中，所述载体还可以包含编码ul49和ge或ge的胞质结构域的多核苷酸。本发明进一步涉及包含编码ul31和ul34的多核苷酸的载体。通常，编码本发明复合物的hsv蛋白的基因也可以存在于超过一个载体上，例如，存在于两个载体上。因此，所述基因中的一种、两种或三种在第一个载体上，而其余的基因在第二个载体上。然而，所述基因中的每种也可以在单独的载体上。然而，优选地，所述基因存在于单一载体上。基因也可以多基因形式存在(ep1945773)。

65、如本文所用的术语“载体”是指一种核酸序列，其中可插入或克隆包含编码目的蛋白质的基因的表达盒。此外，所述载体可以编码赋予宿主细胞选择性的抗生素抗性基因。优选地，所述载体为表达载体。

66、所述载体可包含用于在细菌(如大肠杆菌)、酵母(如酿酒酵母(s.cerevisiae))、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞中繁殖的元件。优选地，所述载体是杆状病毒载体或杆状病毒bacmam载体。所述载体可以具有线性、圆形或超螺旋结构，并且出于某些目的可以与其它载体或其他材料复合。还可以将所述载体整合在宿主细胞基因组中。

67、在bacmam系统中，杆状病毒载体用于将基因递送至哺乳动物细胞中。bacmam系统可用于将基因递送至宽范围的细胞系及原代细胞以作为宿主细胞，其示例性列表包括在本文其它地方。未经修饰的杆状病毒能够进入哺乳动物细胞，然而除非将哺乳动物可识别的启动子引入目的基因的上游，否则其基因不表达。因此，设想本发明的bacmam载体在编码本发明的多聚复合物的蛋白质的基因上游包含哺乳动物启动子。所述载体可包含本文其它地方所述的其它元件，如抗生素抗性基因、用于在大肠杆菌、酿酒酵母等中繁殖的元件。

68、所述载体可含有一或多种其它元件，包括如复制起点、启动子、克隆位点、遗传标记、抗生素抗性基因、表位、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签。本领域技术人员将容易知道哪些元件适用于特定的表达系统。

69、特别地，根据本发明的载体可进一步包含用于在细菌(大肠杆菌)、酵母(酿酒酵母(s.cerevisiae))、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞中繁殖的元件，比如复制起点、选择标记等。

70、设想所述载体包含用于基因表达的启动子。本文所述的编码本发明蛋白的基因中的每种由启动子驱动。优选地，所述启动子选自：polh、p10及pxiv极晚期杆状病毒启动子、vp39杆状病毒晚期启动子、vp39polh杆状病毒晚期/极晚期杂合启动子、pca/polh、pcna、etl、p35、egt、da26杆状病毒早期启动子；cmv-ie1、ubc、ef-1、rsvltr、mt、类人猿病毒40启动子、cag启动子(具有cmv-ie1增强子的β-肌动蛋白启动子)、乙型肝炎病毒启动子/增强子、人类泛素c启动子、杂合神经元启动子、pds47、ac5和pgal及padh。所述基因中的每种之后为终止子序列，比如hsvtk终止子、sv40终止子或牛生长激素(bgh)终止子。

71、术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”或“核酸分子”在本文中可互换使用，是指通常由一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的聚合形式的核苷酸。优选地，术语“多核苷酸”包括单链和双链形式的dna或rna。本发明的核酸分子可包括rna(含有核糖核苷酸)、cdna、基因组dna的有义链和反义链，以及上述的合成形式和混合聚合物。正如本领域技术人员容易接受的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以包含非天然或衍生的核苷酸碱基。这些修饰包括例如标记、甲基化、使用类似物置换天然存在的核苷酸中的一个或者多个、核苷酸间修饰例如中性键(linkage)(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬挂部分(如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和被修饰的键(如α异头核酸等)。还包括合成分子，其模拟多核苷酸通过氢键和其它化学相互作用与指定序列结合的能力。这些分子是本领域中已知的，并且包括例如其中肽键取代分子骨架中磷酸酯键的分子。

72、因此，作为表达产物的核酸优选为rna，而待引入细胞的核酸优选为dna或rna，如合成dna、基因组dna或cdna。

73、还设想一种疫苗组合物，其包含编码本文公开的多聚复合物的核酸或载体。此类核酸或载体可基于dna或rna。根据疫苗组合物应用的合适载体包括基于dna的载体，比如杆状病毒载体、bacmam载体、腺病毒载体、慢病毒载体、aav载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体及eppstein-barr病毒(ebv)载体。还设想使用裸dna；如呈质粒形式及任选地，复合和/或稳定化形式(如脂质复合物(lipoplexe)、人工合成多聚物(polyplexe)、树枝状聚合物、病毒颗粒及具有无机纳米颗粒的复合物)。合适的基于rna的载体包括逆转录载体、semliki森林病毒(semliki forest virus,sfv)、辛得比斯病毒(sindbis virus,sin)及委内瑞拉马脑炎病毒(vee)载体。

74、可以将包含所述多聚复合物的疫苗组合物和包含编码所述多聚复合物的核酸或载体的疫苗组合物用于初免加强方案(prime boost regimen)中。在初免加强方案中，使用由两种或更多种类型的疫苗组成的初免/加强疫苗，所述两种或更多种类型的疫苗包括用于初次免疫(初免(prime或priming))中的疫苗和用于加强免疫(加强(boost或boosting))中的疫苗。用于初次免疫中的疫苗和用于加强免疫中的疫苗可彼此不同。初次免疫和加强免疫可依次实施，然而，这并非强制性的。初免/加强方案包括但不限于如dna初免/蛋白质加强。然而，还可将所述加强组合物用作初免组合物和将所述初免组合物用作加强组合物。

75、宿主细胞

76、本发明进一步涉及一种包含含有编码ul11、ul16和ul21以及任选地ge或ge的胞质结构域的多核苷酸的载体的宿主细胞。在本发明进一步的实施方案中，所述宿主细胞还可包含一种含有编码ul11和ul16的多核苷酸的载体。在本发明进一步的实施方案中，所述宿主还可包含一种含有编码ul16和ul21的多核苷酸的载体。

77、本发明进一步涉及一种包含含有编码ul48、ul49和ge或ge的胞质结构域的多核苷酸的载体的宿主细胞。在本发明进一步的实施方案中，所述宿主细胞还可包含一种含有编码ul48和ul49的多核苷酸的载体。在本发明进一步的实施方案中，所述宿主还可包含一种含有编码ul49和ge或ge的胞质结构域的多核苷酸的载体。

78、本发明进一步涉及一种包含含有编码ul31和ul34的多核苷酸的载体的宿主细胞。

79、所述宿主细胞可为昆虫细胞或哺乳动物细胞。所述宿主细胞还可以是细菌(如大肠杆菌)或酵母菌(如酿酒酵母)。一般而言，可使用适于表达核酸分子以产生本发明的多聚复合物的任何宿主细胞。然而，优选为昆虫和哺乳动物宿主细胞。甚至更优选为昆虫宿主细胞。根据本发明应用的宿主细胞可为昆虫细胞、比如sf9、sf21、super sf9-1(ve-1)、supersf9-2(ve-2)、super sf9-3(ve-3)、hi-5、express sf+及s2 schneider细胞，其中hi-5是优选的[oxford expression technologies,cat.no.600103,oxford,uk；fath-goodin等(2006),adv.virus res.68,75-90；kroemer等(2006),j.virol.80(24),12291-12228和us20060134743.]。可用的示例性哺乳动物宿主细胞是本领域已知的且包括自美国菌种保存中心(atcc)获得的永生化细胞系，包括但不限于hek293、hek293f、cho、hela、huvec、huaec、huh7、hepg2、bhk、mt-2、cos-7、cos-1、c127、3t3、人类包皮成纤维细胞(hff)、骨髓成纤维细胞、bowes黑色素瘤、初代神经细胞或上皮细胞。在bacmam系统中，杆状病毒表达载体用于将基因递送至哺乳动物细胞。

80、产生方法

81、本发明进一步提供一种用于产生包含所述多聚复合物的疫苗组合物的方法，其包括：

82、(i)培养本发明的宿主细胞；

83、(ii)获得多聚复合物；

84、(iii)和将所述多聚复合物与药学上可接受的载体或佐剂混合。

85、应注意，在本发明的多聚复合物的上下文中描述的实施方案加以必要的变通也用于本发明的方法。

86、通过采用杆状病毒(例如杆状病毒表达系统或bacmam表达系统)可以在宿主细胞，优选在昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达所述多聚复合物。“表达载体”在本文中定义为用于将遗传物质转移至所述遗传物质可在该处表达的靶宿主细胞的媒介。“表达系统”为表达载体与该载体的宿主细胞的组合，该组合提供环境以允许外源基因在宿主细胞中表达。本发明的复合物可瞬时或稳定表达。因此，本发明的宿主细胞可以用表达载体瞬时转染，或者如通过在宿主细胞基因组中整合载体，产生稳定的细胞系从而用表达载体稳定转染。

87、杆状病毒表达系统通常基于如经由与含靶基因的转移载体同源重组将外源基因引入至非必要的病毒基因组区域中。所得重组杆状病毒可缺少非必要基因(例如polh、v-cath、chia)的一种，其由编码可在适宜宿主细胞中表达的异源蛋白质的外源基因替代。这些技术通常为本领域技术人员已知且已如由kosta等nat biotechnol.2005；23(5):567-75综述。用于制备重组杆状病毒载体的具体方法为杆状病毒系统(invitrogen)。

88、重组杆状病毒表达载体可能够在宿主细胞且任选地在原核细胞(如大肠杆菌)中复制。根据本发明，可使用源自通常用于蛋白质的重组表达的杆状病毒的任何杆状病毒表达载体。例如，所述杆状病毒载体可源自如acmnpv、家蚕(bombyx mori)(bm)npv、棉铃虫(helicoverpa armigera)(hear)npv或甜菜叶蛾(spodoptera exigua)(se)mnpv。所述杆状病毒载体可为杆粒。

89、需要指出的是，如本文所用，除非上下文另有明确指示，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括所提及的复数。因此，例如，提及的“一种表达盒”包括本文公开的表达盒中的一种或多种，提及的“所述/该方法”包括提及的本领域普通技术人员已知的可修饰或置换本文所述的方法的等效步骤和方法。

90、本说明书及其后的权利要求全文中，除非上下文有其它要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数步骤、或整数或步骤的集合，其并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当在本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够以术语“含有(containing)”替代或当在本文使用时用术语“具有(having)”替代。

91、当本文使用时，“由…组成”排除了未在权利要求要素中规定的任何要素、步骤或成分。当本文使用时，“本质上由…组成”并不排除实质上不影响权利要求的基本特征和新特征的材料或步骤。本文的每一个实例中，术语“包括/包含”、“本质上由…组成”和“由…组成”中任意一个可被其它两个术语中的任意一个替代。

92、如本文所用的术语“约(about)”或“大约(approximately)”的含义是在给定值或范围的20％内，优选地10％内，和更优选地5％内。其还包括具体数目，如，约20包括20。

93、除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应当具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另外规定，否则单数形式的术语应当包括复数形式并且复数形式的术语应当包括单数形式。通常根据本领域熟知的常规方法实施本发明的方法和技术。总体而言，与本文所描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交学的技术结合使用的命名法是本领域熟知并且常用的那些。

94、除非另外指示，否则本发明的方法和技术一般是根据本领域熟知的常规方法并且如本说明书全篇所引用和论述的各种通用和更具体参考文献中所描述来实施。参见如sambrook等，molecular cloning:a laboratory manual,3rd ed.,cold spring harborlaboratory press,cold spring harbor,n.y.(2001)；ausubel等，current protocols inmolecular biology,j,greene publishing associates(1992,and supplements to2002)；handbook of biochemistry:section a proteins,vol i 1976crc press；handbook of biochemistry:section a proteins,vol ii 1976crc press。与本文所描述的分子和细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学和医药化学结合使用的命名法及其实验程序和技术是本领域熟知并且常用的那些。