一种黑枸杞酵素的制备方法及其应用

本发明属于酵素，具体涉及一种黑枸杞酵素的制备方法及其应用。

背景技术：

1、酵素也称“酶”，由蛋白质构成，是一种生物催化剂。酵素是以乳酸菌、酵母菌等多菌种，以水果、蔬菜、菌类、粮谷类、药食同源性食材、动植物成分提取物等为原料，并添加一定量的碳源，经微生物发酵一定时间后得到的富含微生物、酶、矿物质等营养成分的功能性微生物发酵产品。而且益生菌发酵的产品的副作用几乎为零，因此益生酵素是具有生命活力的安全保健品。

2、黑枸杞，为茄科枸杞属，多年生多棘刺落叶灌木，是青海省柴达木和塔里木盆地的主要建群植物之一，被誉为荒漠中的“软黄金”和“黑珍珠”，极具研究和开发价值。同时为公认的药食同源的良好来源，具富含枸杞多糖、黄酮、花青素、多酚、胡萝卜素等生物活性成分，这些活性成分使得枸杞发挥相关功能特性，如降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗视疲劳、抗肿瘤、保护神经系统、调节肠道菌群等。黑枸杞又被誉为“花青素之王”，具有良好的抗氧化能力，是vc的20倍，ve的50倍。黑果枸杞除具有提供人体所需的各种矿物质、氨基酸、脂肪酸等营养功能外,更重要的意义是在于具有一些保健功能。

3、肝脏是人体内酒精代谢的最主要场所。酒精在肝脏中可通过三条途径进行代谢，即细胞质基质上的乙醇脱氢酶系代谢途径(adh)、内质网上的细胞微粒氧化途径(meos)和过氧化氢酶体上的过氧化氢酶氧化途径(catalase)。这三条途径催化酒精脱氢生成乙醛，乙醛再经乙醛脱氢酶(aldh)二次催化快速氧化成无毒的乙酸。其中adh参与和meos是最主要的两条途径。在正常人体中，80-90％酒精经adh途径代谢，10-20％由meos途径代谢，只有不到2％经catalase途径代谢。

4、1、乙醇脱氢酶代谢途径

5、在氧化型辅酶i(nad+)的参与下，adh催化乙醇发生如下反应：

6、ch3ch2oh+nad+→ch3cho+nadh+h+。

7、其中乙醇脱氢酶催化乙醇脱氢生成乙醛，同时nad+被还原形成还原型辅酶i(nadh)。与meos和catalase代谢途径不同，adh不可被诱导，且大量酒精代谢产生的自由基破坏adh稳定性，可能直接导致长期或大量酗酒后肝脏adh的活力降低，进而抑制adh代谢途径。对于酒精性肝病患者来说，随着肝损伤程度加深，肝脏中adh活力也相应降低。酒精经adh途径代谢产生大量nadh，因此长期饮酒会使肝细胞中nadh/nad+比例长期处于较高水平。高nad h/nad+比例可抑制脂肪酸的β-氧化，使脂肪酸在肝脏堆积，导致早期脂肪肝。nadh/nad+比例升高可导致线粒体呼吸链中电子过量流动，电子在线粒体呼吸链复合体i和复合体iii上积累和泄露，从而产生活性氧自由基(ros)，引起肝组织的氧化应激。另外，nadh可为丙酮酸转化为乳酸的过程提供质子，加速乳酸和尿酸生成。因此，饮酒也可能引起高尿酸而疗从而诱发痛风。

8、2、细胞微粒乙醇氧化途径

9、细胞微粒乙醇氧化途径(meos)是基于细胞色素p450酶系的一条代谢途径，其中cyp2e1是催化乙醇氧化最重要的酶，对乙醇的亲和力最高，催化能力最强。然而，长期饮酒或一次性大量饮酒不仅抑制adh参与的氧化途径，还能诱导cyp2e 1表达和分泌，激活meos代谢途径，促进机体的酒精代谢。

10、在还原型辅酶ii(nadph)和o2的参与下，cyp2e 1催化乙醇发生如下反应：

11、ch3ch2oh+nadph+h++o2→ch3cho+nadp++2h2o。

12、其中乙醇脱氢生成乙醛，nadph被氧化成氧化型辅酶ii(nadp+)，而氧分子经过一系列中间反应转化为各种活性氧自由基最终转化为水。从方程式中可以看出，meos是一条耗氧代谢途径，在代谢酒精的同时，也产生大量活性氧自由基(ros)，主要包括经基自由基(·oh)和超氧阴离子(·o2-)。ros在肝组织内大量产生和聚集，进而引起肝脏组织氧化应激，这是诱发肝损伤的重要原因。部分自由基能直接与乙醇结合生成经乙基自由基，经乙基自由基可攻击甲硫氨酸(met)和半肤氨酸(cys)等含硫氨基酸，引起蛋白质结构改变从而影响其功能，最终导致肝脏部分代谢酶系活性降低以及功能性糖蛋白失效。此外，经乙基自由基也能特异性结合谷肤甘肤(gsh)形成稳定的络合物，致使肝细胞中gsh含量降低并抑制其再合成，从而降低肝脏对自由基和氧化应激的自我防御能力。过量累积的自由基也会导致肝脏脂质过氧化，破坏肝细胞通透性，引起肝细胞的病变和凋亡。另外，长期酗酒的病人体内meos长期处于亢奋状态，cyp2e 1分泌过高，对各类药物代谢的半衰期大大缩短，导致药物的治疗效果大大下降，表现出疾病久治不愈的现象。

13、3、过氧化氢酶氧化途径

14、过氧化氢酶氧化途径是通过过氧化氢酶(catalase)的过程。过氧化氢酶是一种重要的抗氧化酶，能催化体内的h2o2彻底分解生成h2o和o2，从而保护细胞免受h2o2及其次生活性氧自由基的攻击。然而，当存在电子供体时，它也能催化h2o2还原为h2o，这一过程通常由过氧化物酶催化。乙醇可以作为一种电子供体，在h2o2参与下，过氧化氢酶催化乙醇发生如下反应：

15、ch3ch2oh+h2o2→ch3cho+2h2o

16、乙醇脱氢生成乙醛，而h2o2被还原成h2o。由于体内h2o2生成速率非常低，因此只有大约2％的酒精会通过这条途径代谢，在正常人体中，这几乎可以忽略。

17、近年来，保肝护肝药物多为化学合成物，食用过量或者不恰当会增加肝脏的负担和肝毒性。而天然植物源成分逐渐成为解酒产品新趋势。

技术实现思路

1、本发明提供了一种黑枸杞酵素的制备方法及其应用。本发明利用黑枸杞本身具有抗氧化性的花青素和多酚活性物质，再利用酿酒酵母发酵产生的sod酶、植物乳杆菌增加抗氧化活性物质的溶出以及两者在发酵中对adh和aldh活性的提升，用来预防和治疗酒精性肝损伤。

2、本发明黑枸杞酵素的制备方法，包括如下步骤：

3、步骤1：将洗净后的黑枸杞与高酰基结冷胶溶液混合并打浆，得到浆料。

4、步骤2：向步骤1所得浆料中加入柠檬酸调节ph值至4.2-4.5，加入复合酶，升温至30-40℃并保持2.0-3.5h。

5、步骤3：将步骤2的体系水浴处理10-15min，使复合酶失活，随后进行巴氏杀菌并冷却，保证样品无菌。

6、步骤4：在无菌条件下，向步骤3获得的浆料中接种活化后的植物乳杆菌，之后放入35℃-39℃恒温培养箱中发酵36h-60h，得到一次发酵浆料。

7、步骤5：向一次发酵浆料中接种活化后的酿酒酵母，在27℃-30℃恒温培养箱发酵36-60h，得到二次发酵浆料。

8、步骤6：将二次发酵浆料巴氏杀菌，之后离心、纱布过滤，得到酵素液。

9、步骤1中，所述高酰基结冷胶溶液的浓度为0.02％-0.1％；黑枸杞与高酰基结冷胶溶液的质量计为1:3-4。

10、步骤2中，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，复合酶比例为7：3。所述复合酶的添加量为浆料总质量的0.1％～0.2％。

11、步骤3中，灭酶温度为60-70℃。

12、步骤4中，植物乳杆菌的接种量为浆料质量的2％-4％。植物乳杆菌在使用前接种于mrs肉汤培养基中，并在37℃水浴摇床活化18-24h，保持接种时活菌数为1×107cfu/ml。

13、步骤5中，酿酒酵母的接种量为浆料质量的2％-3％。在使用前接种于麦芽汁培养基中，并在28℃水浴摇床活化42-48h，保持接种时活菌数为1×106cfu/ml。

14、步骤5中，先将步骤4获得的一次发酵浆料巴氏杀菌，再进行二次发酵过程。

15、所述巴氏杀菌是于65℃灭菌30min。

16、本发明黑枸杞酵素在制备药物制剂、功能性食品和保健品中的应用。

17、所述药物制剂具有预防和/或治疗酒精性肝损伤的功效。

18、所述功能性食品和保健品具有预防和/或治疗酒精性肝损伤的功效。

19、本发明的有益效果体现在：

20、本发明以黑果枸杞为主要原料生产酵素产品，产品生产中无需高温加热环节，产品中的花青素可得到有效保存，并且将打浆的水换成了高酰基结冷胶溶液，极大的防止花青素的氧化，且高酰基结冷胶也是安全无毒的高分子线性多糖，在酸性条件下水解产生糖分。在保持黑枸杞原有活性成分的基础上，利用益生菌进行发酵，一方面可增加原有活性成分的溶出，更重要的一方面益生菌可以利用黑枸杞内的营养物质，产生其他有益物质，增加乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，提高乙醇和乙醛在体内的转化，防止肝损伤。